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细胞流体实验
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流动状态的细胞培养影响
RNA-binding protein
quaking(QKI)
表达
内皮层的细胞与细胞间的联系对于其发挥正常的生理作用有非
常重要的作用。
细胞间联
系不仅会影响包括囊泡的释放和白血球
渗出，
并进一步影响血管生成过程。
荷兰的科学
家发现
RNA-binding protein quaking(QKI)
表达收到流动状态的细胞培养环境的影响。
流动
刺激下，其表达时间变长，并且转录因子
KLF2
会结
合到其启动子上。进一步，科学家
们发现
quaking
会直接和
VE-cadherin
和
β
-cadherin
的
mRNA
相结合，
并且能通过
3
’
UTR
直接诱导
mRNA
的翻译。
科学家们将
HUVECs
种在通道载玻片上，并且为其
提供
10dyne/cm
2
的持续的剪
切力，
进行长达
7
天的培养。之后，科
学家们分析流体剪切力处理后的细胞表达的
RNA
并且
直接对其进行免疫荧光染色。
一、实验准备实验材料及设备
1
）细胞：
HUVECs
2
）试剂：
3.7% formalin
（
Mi
llipore
）
0.5% Triton X-100
（
Sigma-Aldrich)
Hank
’
s Balanced
Salt Solution containing
Ca
2+
and
Mg
2+
（
HBSS
Gibco
）
3
）培养耗材：
ibidi
六通道载玻片
μ
-Slide VI
0.4
Luer
（
ibidi
，
Germany
，
80606
）
灌流管，
15cm
，
1.6mm
直径（
ibidi
，
Germany
< br>，
10962
）
串联管（
ibidi
，
Germany
，
1083
0
）
封口夹
4
）仪器设备：
ibidi
流体剪切力系
统，含空气泵（
ibidi
，
Germ
any
，
10905
）和流体单元
（
ibidi
，
G
ermany
，
10903
）
二、实验方法
<
/p>
在实验开始前一天，
请将所有需要使用的试剂，
< br>培养基，
通道载玻片，
灌流管都在
37
℃
的二氧化碳培养箱中放置过夜，排除由于温度差产生的
微量气泡。
一）培养细胞
准备
< br>HUVECs
，按照常规细胞培养方法进行培养。最好使用比较健康的内皮细胞，
以防
在做流体实验时候细胞不能稳定贴壁。
按照下面流程铺细胞：
1
）按细胞密度为
1.5* 10
6
cell/ml
铺细胞，
注意，
将移液器头插入注液孔中再加入细胞
悬
液，可以轻微倾斜通道载玻片帮助细胞悬液充满整个通道。
2
）盖上注液孔盖，将通道载玻片放入细胞培养箱中培养半小时，等待细胞贴壁。细胞
贴壁后，拿出通道载玻片，在每个注液孔中分别加入
60
μ
l
培养基，注意，枪头要悬
在孔上方滴入培养基。
3
）将通
道载玻片再放入二氧化碳培养箱进行培养
3
小时左右，等到细胞
刚刚长满为单
细胞层，即可开始实验。注意，要使用单层细胞进行剪切力实验，使每个细
胞均受
到均匀的剪切力。
二）搭建流体系统
1
）将灌流管按照说明放在置在流体单元上。
在灌流管的储液管中分别加入
8ml
培养基。
这时不需要连接通道载玻片。
实验前需要去除整个灌流管中的气泡，
存留在灌流系统的
气泡会影响剪切力的大小，
有时还会使灌流系统中的液体流动停滞。<
/p>
打开
ibidi
泵控制
< br>系统，在任务栏中找到“
Remove air bubbles
”
，
ibidi
流体剪切力系
统将自动运行下
1
）
压力
50mbar
剪切力
流速
持续时间
不限
None
（
no slide)
23.4ml/min
面任务，用于去除气泡。
（表一）
2
）连接
通道载玻片。使用串联管，将通道串联起来。这样可以在同一个条件，同一种
液体的刺激
下培养不同的样本。
在细胞贴壁后，将串联管如如图示插入串联管
在每一个注液孔中加满培养基，要注意不能把气泡加入在注液
孔中。
用
1ml
的无菌注射器吸满培养基，小心插入如图的孔中，不要引入气泡。
小心推入培养基，直到第一个串联管有培养基微微冒出。
小心的将串联管弯过来，插入相邻的注液孔中。不要产生气泡。
继续推动注射器，直到第二根串联管也被充满，继续推动注射
器充满下一根串联管。
重复上面的操作，继续充满所有的通道和串联管。
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