-
mRNA
作为基因治疗：怎样控制蛋白质表达
鞠俊
生物技术基地班
关键词
：
mRNA
转运，脂质体，细胞核障碍，多聚腺嘌呤
尾，
mRNA
疫苗
< br>摘要
：很多年来，在人们看来，在有效的基因治疗中，
m
RNA
是不稳
定的。但在过去十年，几个研究团队面对挑战，不
仅用令人惊奇的结
果，
即蛋白质的连续的高效表达证明了
mRNA
调节转染的可行性，
而
且证明比起质粒
DNA
有一些优势。
这些优势将在这篇综述中被提到。
在所有优势中，首先被强调的是，
mRNA
不需要穿过核膜去发挥它的
生理作用；而
且由于缺少了
CpG
岛的修饰，所以减少了细胞免疫反
应。另外，这篇综述还提到
mRNA
分子的稳定性，
mRNA
的修饰以
增加它的半衰期以及外源
mRNA
被成功用作转染的必要性。
而且，<
/p>
这
篇综述总结了用作
mRNA
转染的不同的技术和载体，主要有电打孔，
基因枪注射和脂质体转染。
并且暗示，
现在大多数的注意力集中在疫
苗
开发方面。
总之，
这篇综述提供了一个广阔的视角，
关于
mRNA
转
染的主要
的理论知识和实际操作以及它在科学研究中的可能性和缺
陷
<
/p>
简介
:
人们对
m
RNA
代替质粒
DNA
在基因治疗中的
兴趣，
最近才有所
增强。很长一段时间，
mRNA
被认为是一种不稳定的分子。在过去的
二十年，
mRNA
转染的研究一直进行着。研究组大部分运用非病毒的
方式来完成转染，也有一些使用病毒载体的。所有这些工作证明
mRN
A
的不稳定性被过分估计了。
mRNA
转染是一种可以取代质粒
DNA
的治疗方法。
< br>
mRNA
进入细胞后，它的生命是有限的；由这个
mRNA
编码的蛋白质
只是持续几天的时间
。
显然，
这限制了
mRNA
转染的实用性。
它不能
被应用于遗传疾病的治疗，
因为治疗需要持续的表达。然而，当只需
要短暂的蛋白表达量时，
以
mRNA
为基础的基因治疗能够比质粒
DNA
的使用更有效。这种情况下，
mRNA
的转染不仅能完成所有的治疗要
求，而且有超过质粒
DNA
的几个优势。这里，我们将比较
mRNA
和
质粒
DNA
，
强调在非病毒途径中，
外源
mRNA
转染有效性的保证以及
讨论它的可能应用。
2.
mRNA
作为质粒
DNA
的替代
这里我们将讨论比起质粒
DNA
，<
/p>
mRNA
转染的优势。首先
mRNA
比
质粒
DNA
安全
，不像质粒
DNA
，
mRNA
不能整合到基因组上。因此
排除了插入突变。
另
一个额外的优势是
mRNA
能作为相对简单的治疗
小分子。
在转染结构中，
没有必要去选择和插入强的
启动子和终止子。
核膜对质粒
DNA
是
一个障碍，而
mRNA
不用进入核内发挥作用。而
且
，
mRNA
缺
少
能
引
起
免
疫
反
应
的
CpG
岛
修
饰
。
2.1
核膜的障碍对质粒
DNA
，与
mR
NA
无关
多种细胞内和细胞外的障碍
对非病毒的转染造成了严重的限制。
脂质
体和聚合物提高了质粒
DNA
的吸收和核内体的逃逸，于是核膜成为
< br>非病毒转染的主要障碍。几个研究小组证明质粒
DNA
注
入非分裂细
胞的细胞质中，结果基因的表达很低。相反，将相同质粒
DNA
的拷
贝注入到细胞核中，结果是注射细胞全部被转染
。
质粒
DNA
进入细胞核可能是在细胞分裂时期，
因为核膜暂时消失了。
事
实上，分裂的细胞比起静止细胞，更利于转染。尽管如此，在分裂
的细胞中，
进入细胞核的拷贝还是很低。
不超过
10%
的细胞质的质粒
进入了细胞核。而且核膜暂时的缺失不能被用作一般的
基因治疗中，
因为在大多数情况下，靶细胞不分裂。
一种使质粒
DNA
进入非分裂细胞核的可能通道
是核孔复合物。核孔
复合物是由
50-100
< br>种蛋白组成的，位于核膜上的孔。小于
9
纳米的
分子能自由通过，
更大的分子则需要能量和特异的受体。
不同的方法
已经被使用，以提高质粒
DNA
进入核孔的效率，例如核定位信号。
核定位信号能共价连接到质粒
DNA
上，
而且需要小心连接到质粒
DNA
的功能区域。已经证明，核定位信号共价连接到线性
DNA
上增加荧
光素酶的表达达到
150
倍。
但没有报告显示核定位信号特异的序列效
应。但是，也有报告称核定位信号对转染效率不起作用。这种增强作
用
只针对线性
DNA
而不是质粒
DNA<
/p>
。核定位信号的有限的成功只是
在体外，
很难在体内实现。
在虾和斑马鱼胚胎中，与
NLS
相连的质粒
DNA
复合物的核吸收和基因表达增强了
。但
NLS
提高质粒
DNA
在成
年动物中的转染效率还没有充分的证据。
<
/p>
综上，
所有这些报告表明，
通过
NPC
的质粒
DNA
的
运输不是很有效，
这严重降低了基因转运的效率，
特别是在非分
裂的细胞中。
而克服核
膜障碍的最有效的途径是发展出一套细胞
质表达系统。
mRNA
能完美
的完成整
个过程。它不用进入细胞核，从而避免了转染的限制因素。
mRNA
能被运用于人体各种细胞的转染，
包括血管内皮细胞，
肌细
胞，
脑细胞。
2.2
非甲基化
CpG
修饰的免疫反应
在进化的过程中，我们的免疫系统已经学会了识别和消除外来
DNA
。
未甲基化的
CpG
岛修饰和一些病毒
RNA
是引起免疫应答的基
本信号。
已经证明细菌
DNA
诱导
B
细胞，单核白细胞，树突细胞和巨噬细胞
的激活，
也刺激天然杀伤细胞的裂解活性，
导致急性炎症。
而且，
CpG
岛修饰和其它的因子，可能在
自身免疫疾病中发挥作用。包含
CpG
岛修饰的质粒
DNA
的转染的成功率是有限的。
转染阳离子载体和非甲基化
DNA
到肺细胞，观察到
炎症反应；当阳
离子载体与包含甲基化或者包含减少
CpG
修饰数量的
DNA
复合时，
细胞因子的浓度很低。
这些实验都表明在转染中，
甲基
化和减少
CpG
修饰的数量是有必要的。质粒的甲基化通过
CpG
甲基化酶的作用实
现。尽管甲基化的
DNA
带来了好的效果，但它不能解决与质粒有关
的所有问题。例如，甲基化的质粒和未甲基化的质粒一样，都会引起
血液中淋
巴球和血小板数量的减少。
而且甲基化抑制了很多启动子的
活性
，
妨碍了基因的表达。
一种可替代的方法是在质粒中插入一段序
列，
比如
GGAGGG
，
可以抵消
CpG
岛修饰引起
的炎症反应。
另一个方
法是通过生化方法去除
< br>CpG
。
大多数氨基酸由多个密码子编码，
这使
得
CpG
的消除变得简
单。不幸的是，在启动子区和复制区的
CpG
序
列的消除会严重影响基因的功能。而且，双链
DNA
激
活了中性粒细
胞和
B
细胞，这是不依靠
CpG
的方式。
mRNA
缺少
CpG
序列，
所以表现出减少的免疫效应。
基于上面所述的，
mRNA
作为基因转染显得更加诱人。
3
．
mRNA
的稳定性
因为
mRNA
的结构和
生物合成已被阐明，
普遍认为
mRNA
是很不稳定
的分子，特别是到达细胞质中，这里，它暴露在降解酶中。它的不稳
定的原因是糖配基的第二个碳原子上的羟基的存在。由于空间位阻，
使得
mRNA
不能采用稳定的双链螺旋结构，
而趋向于降解。
最初人们
怀疑，
<
/p>
mRNA
不稳定，所以不能够抵抗转染。尽管如此，它的一些
特点提供了可接受的半衰期。
影响
mRNA
的降解的因子，
包括顺式作
用元件和反
式作用因子。这里，我们只讨论顺式作用。
mRNA
的
5
端有一个转录后的
m7GpppN
的帽子结构。这个修饰在
mRNA
剪辑，稳定和转运方面发挥作用。最重要的是，它促进了翻译
过程中核糖体的
招募。真核起始因子，是全酶复合物的结构分子，而
RNA
解旋
酶
eif4
和
eif3.
是直接与核糖体
40S
亚基相连的复合物。
帽子
结构促进核糖体的募集，
这个观念受到了考
验，
因为一些病毒和细胞
mRNA
能在
丢失
5
端帽子结构的情况下募集核糖体。尽管如此，帽子
结
构
对
正
常
mRNA
功
能
还
是
很
重
要
的
。
< br>首先，
mRNA
帽子与相关的蛋白异质二聚体相连。这个
蛋白复合物调
节
mRNA
从细胞质到细
胞核的转运，通过无义调节的
RNA
降解，在
< br>mRNA
分子的质量控制中起关键作用。
mRNA
的降解在细胞质的
P
位
点发生。到现在，超过
40
种
P
蛋白被鉴定。包括
Xrn
核酸外切酶，
去腺苷酸化酶。这个帽子结构保护
mRNA
免受细胞质中的
Xrn1
和细
胞核中的
Xrn2
降解，因为它的
5-5
磷酸酯键的连接。
这个帽子结构是
mRNA
分子的必须组分，
特别是当想引入一个
外源的
mRNA
时。
mRNA
在体外合成时，帽结构能够通过
3
’
或
5
’
的侧面，连
接到
mRNA
的
5<
/p>
’
端。然而只有
5
’
-5
’
的磷酸酯键连接才产生可翻
译的
mRNA
。体外合成的
mRNA<
/p>
只有一半能发挥功能。这个问题能通过抗
倒转帽类似物的使用被解
决。它能在
3-OH
处甲基化以修饰帽结构，
< br>使得
ARCA
在正确的方向被插入，于是得到了全部可翻
译的
mRNA
。
最近，通过延长
5
’
-5
’
桥到一个四磷酸盐，又一次增强了翻译活性和
ARCA
< br>的稳定性。
用常规的帽结构和
mARCA
转染海拉细胞，
比较荧光
素酶的表达量。脂质体被用于
导入
mRNA
。脂质体一样时，两者的翻
译效率差不多。
在相同的时间，酶的活性是没有区别的。当脂质体转
< br>入包含血清的培养基时，
ARCA
在
mRNA
中的存在才显露出优势。这
时，荧光素酶活性能在
5
天被检测到。这些人观察到含有
AR
CA
帽结
构的
mRNA
比起普通的
mRNA
有更高的翻译效率。用海拉细胞孵
育，
有血清的情况下。有趣的是，用裸露的含有类似物帽子结构的
mRNA
转染电穿孔的海拉细胞，荧光素酶的活性在
24
小时内消失。而用含
有
ARCA
帽子结构的
mRNA
转染，能够延长标记蛋白质的
表达。所有
数据说明，含有
ARCA
的
帽结构
mRNA
能够延长表达，如果
m
RNA
复
合物在有血清的状态下孵育或者是直接达到细胞质中。
转录后的
mRNA
的
3
’
端在酶的催化下，增加一个聚腺苷酸的尾。这个聚腺苷酸
尾是很关键的。
已经表明所有有活性的
mRNA
都带有
100-250
个聚腺
苷酸尾。为了达到翻译效率，外源
mRNA
必须有至少
20
个聚腺苷酸
的尾。而且显示蛋白表达量
与腺苷酸尾的长度相关。
几个研究小组报道，
mRNA
包含一个细胞质聚腺苷酸元件，它能起始
细胞
质中的聚腺苷酸尾的延长。这样，抑制状态的
mRNA
能被激活
。
直到现在，这个过程只是在细胞早期发育中被观察到。
帽
结
构
和
polyA
在
翻
译
中
的
协
同
作
用
已
被
证
明
。
通
< br>过
形
成
cap-
eIF4E-eIF4G-PABP-poly(A)
的封闭结构表现协同作用，
促进了核糖体
的循环和保护
mRNA
免受核酸外切酶的降解。另外也有报道，
eIF4G
–
PABP
相互作用的打乱，形成了协同效应。这个是在细
胞中观
察到，
而不是非细胞体系，
说明
细胞中竞争性
mRNA
的存在能增强帽
结构和
polyA
的结合。实验证明，含有
polyA
的转染使得翻译效率增
加了
2-9
倍。
大多数的真核
mRNA
在
3
’
端含有
mRNA
的衰减信号，
即很多富含
A-U
序列的存在。
它在不同范围内影响了
mRNA
的稳定性。
已经证明包含
UTR
的
mRN
A
是不稳定的
。
而且当用稳定
mRNA
的
UTR<
/p>
替换
ARE
时，
它们的半衰期延长。
ARE
造成
mRN
A
不稳定的机制还没有被理解。
特
殊的
AU
序列用自己的方式使得
mRNA<
/p>
不稳定，
一方面依靠
mRNA
自
身，
一方面与细胞类型和生长环境有关。
当和其它特别的
mRNA
序列
或者
ARE
连接蛋白相互作用时，
ARE
引起的不稳定能够增加或者减
少，
< br>。有趣的是，
ARE
结构上不稳定，或许是作为调节元件
。
-
-
-
-
-
-
-
-
-
上一篇：《三味书屋》的六年级语文教案
下一篇：《牛和鹅》优秀教案2