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什么是高通量测序？
高通量测序技术（
High-throughput sequ
encing
，
HTS
）是对传统
Sanger
测序（称为一代测
序技术）革
命性的改变
,
一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定
,
因此在有些文献
中称其为下一代测序技术
(nex
t generation sequencing
，
NGS
)
足见其划时代的改变
,
同时高
通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能
,
所以又被称为
深度测序
(Deep
sequencing)
。
什么是
Sanger
法测序（一代测序）
Sanger
法测序利用一种
DNA
聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。
直到掺入一种链
终止核苷酸为止。
每一次序列测定由一套四个
单独的反应构成，
每个反应含有所有四种脱氧
核苷酸三磷酸
(dNTP)
，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸
(ddNTP)
。由于
ddNTP
缺乏延伸所需要的
3-OH
基团，使延长的寡聚核苷
酸选择性地在
G
、
A
< br>、
T
或
C
处终止。终
止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种
dNTP
s
和
ddNTPs
的相对浓度可以调整
，使反应
得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。
它们具有共
同的起始点，
但终止在不同的的核苷
酸上，可通过高分辨率变性
凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用
X-
光胶片放射
自显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序（
Genome Re-
sequencing
）
全基因组重
测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，
并在个体或群体水平上进行差
异性分析的方法。
随着基因组测序成本的不断降低，
人类疾病的致病突变研究由外显子区域
扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、
双末端测序相结合的策
< br>略进行高通量测序，
实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、
低频、
甚至是罕见的突变
位点，以及结构变异等，具有
重大的科研和产业价值。
什么是
de
novo
测序
de novo
测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，
利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，
组装，
从
而获得该物种的基因组图谱。
获得一个
物种的全基因组序列是加
快对此物种了解的重要捷径。
随着新一代测序技术的飞速发展，
基
因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，
大规模基
因组测序渐入佳境，
基因组学
研究也迎来新的发展契机和革命性
突破。
利用新一代高通量、
高效率测序技术以及强大的生
物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
什么是外显子测序（
whole exon
sequencing
）
外显子组测
序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域
DNA
捕捉并富
集后进行高通量
测序的基因组分析方法。
外显子测序相对于基因
组重测序成本较低，
对研究已知基因的
SNP
< br>、
Indel
等具有较大的优势，但无法研究基因组结构
变异如染色体断裂重组等。
什么是
mRNA
测序
（
RNA-
seq
）
转录组学（
transcriptomics
）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特
定细胞在某一功能
状态下所能转录出来的所有
RNA
（包括
mRNA
和非编码
RNA
）的类型与拷贝数。
Illumina
< br>提供的
mRNA
测序技术可在整个
mRNA
领域进行各种相关研究和新的发现。
mRNA
测序不
对引物或探针进行设计，
可自由提供关
于转录的客观和权威信息。
研究人员仅需要一次试验
即可快速生
成完整的
poly-A
尾的
RNA
完整序列信息，
并分析基因表达、
cSNP
、
全新的转录、
全新异构体、
剪接位点、
等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。
简单的样
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品制备和数据分析软件支持在所有物种中的
mRNA
测序研究。
什么是
small
RNA
测序
Small
RNA
（
micro RNAs
、
siRNAs
和
pi RNAs
）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调<
/p>
控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。
Illumina
能够对细胞
或者组织中的全部
Small RNA
进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将
18-30
nt
范
围的
Small
RNA
从总
RNA
中分离出
来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成
cDNA
再
做进一步处理后，利用测序仪对
DNA
片段进
行单向末端直接测序。通过
Illumina
对
Small
RNA
大规模测序分析，
可以从中获得物种全基因组水平的
miRNA
图谱，<
/p>
实现包括新
miRNA
分子的挖掘，其作
用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、
miRNAs
聚
类和表达谱分
析等科学应用。
什么是
miRNA
测序
成熟的
microRNA
（
miRNA
）是
17~24nt
的单链非编码
RNA
分子，通过与
mRNA
相互作用
影响目标
m
RNA
的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控着基因表达、细胞生长、发育
等生物学过程。
基于第二代测序技术的
micr
oRNA
测序，
可以一次性获得数百万条
microRNA
序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已
知和未知的
microRNA
及其表达差异，为研究
microRNA
对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。
什么是
Chip-seq
染色质免疫共沉淀技术（
ChromatinImmunoprecipi
tation
，
ChIP
）也称结合位
点分析法，是
研究体内蛋白质与
DNA
相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性
修饰位点的研究。将<
/p>
ChIP
与第二代测序技术相结合的
Ch
IP-Seq
技术，能够高效地在全基
因组范围内检测与组蛋白
、转录因子等互作的
DNA
区段。
ChIP-Seq
的原理是：首先通
过染色质免疫共沉淀技术（
ChIP
）特异性地富集目的蛋白结
合
的
DNA
片段，并对其进行纯化与文
库构建；然后对富集得到的
DNA
片段进行高通量测序。
研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，
从而获
得全基因组范围内与
组蛋白、转录因子等互作的
DNA
区段信息。
什么是
CHIRP-Seq
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA
Purification )
是一种检测与
RNA
绑定的
DNA
和蛋
白的高
通量测序方法。
方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针，
把目
标
RNA
拉下来以后，
与其共同作用的
DNA
染色体片段就会附在到磁珠上，最后把染色体片段做高通
量测序，这
样会得到该
RNA
能够结合
到在基因组的哪些区域，但由于蛋白测序技术不够成熟，无法知
道与该
< br>RNA
结合的蛋白。
什么是
RIP-seq
RNA Immunoprecipitation
是研究细胞
内
RNA
与蛋白结合情况的技术，
是了
解转录后调控网
络动态过程的有力工具，能帮助我们发现
miR
NA
的调节靶点。这种技术运用针对目标蛋白
的抗体把相应的<
/p>
RNA-
蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在
复合物上的
RNA
进行测序分析。
RIP
可以看成是普遍使用的染色质
免疫沉淀
ChIP
技术的类似应用，
但
由于研究对象是
RNA-
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蛋白复合物而不是
DNA-
蛋白复合物，
RIP
实验的优化条件与
ChIP
实
验不太相同
（如复合物
不需要固定，
R
IP
反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有
RNA
酶，抗体需经
RIP
实验验证
等等）
。
RIP
技术下游结合
microarray
技术被称为
RIP-C
hip
，帮助我们更高通量地了解癌症
以及其它疾病整体水平的
RNA
变化。
什么是
CLIP-
seq
CLIP-seq,
又
称
为
HITS-CLIP
，
即
紫
外
交
联
免
疫
沉<
/p>
淀
结
合
高
通
量
测
序
(crosslinking-immunprecipitation and high- throughput sequencing),
是一项在全基因组水
平揭示
RNA
分子与
RNA
结合蛋白相互作用的革命性技术。其主要原理是基于
RNA
分子与
RNA
结合蛋白在紫外照射下发生耦
联，
以
RNA
结合蛋白的特异性抗体将
RNA-
蛋白质复合体
沉淀之后，回收
其中的
RNA
片段，经添加接头、
RT
-PCR
等步骤，对这些分子进行高通量测
序，再经生物信息学
的分析和处理、总结，挖掘出其特定规律，从而深入揭示
RNA
结合蛋
白与
RNA
分子的调控作用及其
对生命的意义。
什么是
metagenomic
（宏基因组）
Magenomics
研究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细
菌研究来说，它具有众多优
势，其中很重要的两点：
(1) <
/p>
微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它们的很多特
性是
基于整个群落环境及个体间的相互影响的，
因此做
Metage
nomics
研究比做单个个体的
研究更能发现其特性；
(2)
Metagenomics
研究无需
分离单个细菌，可以研究那些不能被实
验室分离培养的微生物。
宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。
宏基因组学
（又称元基因组学，
环境基
因组学，生态基因组学等）
，是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质
的学科。传统
的微生物研究依赖于实验室培养，
元基因组的兴起
填补了无法在传统实验室中培养的微生物
研究的空白。过去几年中，
DNA
测序技术的进步以及测序通量和分析方法的改进使得人们
得以一窥这一未知的基因组科学领域。
什么是
SNP
、
SNV
（单核苷酸位点变异）
单核苷酸多态性
singlenucleotide
polymorphism
，
SNP
或单核苷酸位点变异
SNV
。个体间<
/p>
基因组
DNA
序列同一位置单个核苷酸变
异
(
替代、插入或缺失
)
所引起的多态性。不同物种、
个体基因组
DNA
序列同一位置上的单个核苷酸存在差别的现象。
有这种差别的基因座
、
DNA
序列等可作为基因组作图的标志。
人基因组上平均约每
1000
个核苷酸即可能出现
1
个单核
苷酸多态性的变化，其中有些单核苷酸
多态性可能与疾病有关，但可能大多数与疾病无关。
单核苷酸多态性是研究人类家族和动
植物品系遗传变异的重要依据。
在研究癌症基因组变异
时，相对
于正常组织，癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变（
somatic muta
tion
）
，
称做
SNV
。
什么是
INDEL
(
基因组小片段插入）
基因组上小片
段（
>50bp
）的插入或缺失，形同
SNP/SNV
。
什么是
copy number variation
（
CNV
）
：基因组
拷贝数变异
基因组拷贝数变异是基因组变异的一种形式，通常
使基因组中大片段的
DNA
形成非正常的
拷贝数量。例如人类正常染色体拷贝数是
2
，有些染色体区域
拷贝数变成
1
或
3
，这样，该
区域发生拷贝数缺失或增加，
位于该区域内的基
因表达量也会受到影响。
如果把一条染色体
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分成
A-B-
C-D
四个区域，则
A-B-C-C-D/A-C-B-
C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D
分别发生了
C<
/p>
区域的
扩增及缺失，扩增的位置可以是连续扩增如
A-B-C-
C-D
也可以是在其他位置的扩增，如
A-C-B-
C-D
。
什么是
structure variation
（
SV
）
：基因组结构变
异
染色体结构变异是指在染色体上发生了大片段的变异。
主要包括染色体大片段的插入和缺失
（引起
CNV
的变化）
，染色体内部的某块区域发生翻转颠换，两条染
色体之间发生重组
（
inter-chromosome
trans-location
）等。一般
SV
的展示利用
Circos
软件。
什么是
Segment
duplication
一般称为
S
D
区域，串联重复是由序列相近的一些
DNA
< br>片段串联组成。串联重复在人类基
因多样性的灵长类基因中发挥重要作用。在人类
染色体
Y
和
22
号染色体上，有很大的
SD
序列。
什么是
genotype and
phenotype
既基因型与表型；一般指某些单核苷酸位
点变异与表现形式间的关系。
什么是
Read
高通量测序平台产生的序列标签就称为
reads
。
什么是
soft-clipped
reads
当基因组发生某一段的缺失，
或转录组的剪接，
在测序过程中，
横跨缺失位点及剪接位点
的
reads
回帖到基因组时，一条
r
eads
被切成两段，匹配到不同的区域，这样的
reads<
/p>
叫做
soft-clipped reads
，这些
reads
对于鉴定染色体结构变异及外源序列整合
具有重要作用。
什么是
multi-hits
reads
由于大部分测序得到的
r
eads
较短，
一个
reads
能够匹配到基因组多个位置，
无法区分其真
实
来源的位置。一些工具根据统计模型，如将这类
reads
分配
给
reads
较多的区域。
什么是
Contig
拼接软件基于
reads
之间的
overlap
区，拼接获得的序列称为
Contig
（重叠群）
。
什么是
Scaffold
基因组
de novo
测序，通过
reads
拼接获得
Contigs
后，往往还需要构建
454 Paired-
end
库
或
Illumina
Mate-pair
库，以获得一定大小片段（如
3Kb
、
6Kb
、
10Kb
、
20Kb
）两端的序列。
基于这些序列，可以确定一些
Contig
之间的
顺序关系，这些先后顺序已知的
Contigs
组成
Scaffold
。
什么是
Contig N50
Reads
拼接后会获得一些不同长度的
Co
ntigs
。
将所有的
Contig<
/p>
长度相加，
能获得一个
Contig
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