-
0
引言水稻
(Oryza
sativa L.
源于淡水沼泽植物,因此对盐较为敏感。水稻作为
中国第一大粮食作物,现正面临可耕种面积逐渐缩小的尴尬。一些因素导致的土壤
盐碱化也是导致水稻耕种面积缩小的原因之一。在亚洲,
2150hm 2
水稻受到盐胁
迫的危害,而且这种情况仍在不断加剧。因此,研究、培育耐
盐水稻品种,提高土
地利用率,从而扩大水稻种植面积,提高水稻产量已刻不容缓。目前
,国内外已克
隆了一些耐盐相关基因,并转化水稻,获得了耐盐性较高的转基因水稻。此
文就转
耐盐基因水稻及耐盐相关新基因克隆的研究现状做简要综述。
1
耐盐转基因水稻研究
基因工程技术的诞生使得水稻育种变得容易,通过将耐盐基因转化到盐敏水稻
< br>品种中提高了盐敏水稻对盐的耐受能力。
1.1
渗透相关基因
植物在盐胁迫下,细胞会代偿性地增加一些相容性物质,降低细胞的渗透势,
保
护酶和细胞膜结构,清除氧自由基
[1]
。这些物质包括:脯氨
酸、甜菜碱、果
糖、蔗糖、多胺等。它们具有较强的亲水力,可以代替蛋白质、蛋白复合
物或膜表
面的水
[1]
。
基金项目:福建农林大学校青年教师基金
(06B
03
。
第一作者简介:陈煜,女,<
/p>
1977
年出生,四川泸州人,讲师,硕士,主要从
事植物分子生物学研究。通信地址:
350002
福
建福州金山福建农林大学生命科学
学院,
Tel
:
,
E-mail
:
chenyuyu521@
。
通讯作者:柯玉琴,女,
1954
年出生,福建莆田人,教授,大普,主要从事
植物逆境生理生化研究。通信地址
:
350002
福建福州金山福建农林大学生命科学
学院,
Tel
:
,
E-mail
:
yuqin_ke@
。
收稿日期:<
/p>
2010-01-06
,修回日期:
20
10-02-27
。
水稻耐盐相关基因的克隆及转化研究进展
陈煜,杨燕凌,谢小芳,柯玉琴
(福
建农林大学生命科学学院,福州
350002
)
摘要:盐分是影响水稻生长发育的重要环境因素之一。伴随工业化进程及淡水
资源的匮乏而出现的土壤盐碱化是当今水稻育种需要突破的一个难点。在此背景
下,克隆耐盐基因和培育耐盐转基因水稻成为水稻育种的新的技术手段。作者在耐
盐转基因水稻研究、耐盐相关新基因的克隆两个方面进行了综述,以期能使水稻育
种科技人员对该领域有较为全面的了解,同时能为他们的科研工作提供一些借鉴。
最后
,对盐胁迫下转基因水稻的前景以及存在的问题进行了展望和讨论。
关键词:水稻;耐盐基因;基因克隆;转基因水稻;研究进展
中图分类号:
S511
文献标志码:<
/p>
A
论文编号:
2009-0053
Research Progress on Cloning and
Translation of the Salt Resistance Genes in Rice
Chen Yu, Yang Yanling, Xie Xiaofang, Ke
Yuqin (College of Life Science, Fujian
Agriculture and Forestry University ,
Fuzhou 350002 Abstract :Salinity is one of the
factors which affect the growth and
development of rice. At present,
Soil
salinization, which followed with the
industrialization progress and the lack of fresh
water resource, became one difficult
point in the rice
breeding.
In such situation, cloning genes of
salinity resistance and raising
transgenic rice
of salinity
resistance are the new
methods
for
rice
breeding. Transgenic rice with salinity
resistance and new genes cloned
recently were reviewed as to support totally
comprehension and advice for
researchers. At last, prosperity of
transgenic rice with salt resistance was predicted
and the problems exist in
it
were discussed. Key words :rice (Oryza sativa L.;
salt resistance genes; gene clone;
transgenic rice; research progress
中国农学通报
2010,26(11:23-27
Chinese Agricultural Science
Bulletin
中国农学通报
1.1.1
脯氨酸脯氨酸是水溶性最大的氨基酸,分布最广的渗透调节剂。它不仅
作为
渗透调节剂降低细胞质的水势,维持胞质的水分状况,还是一种保护剂,使胞
内大分子物
质免受盐离子的毒害
[2]
。而且还参与氮代谢和能量代谢
p>
[3]
。
P5CS(2-
< br>氢
吡咯
-5-
羧酸合成酶
基因是一个双功能基因,编码
γ
-
谷氨酰激酶
(γ
-GK
和谷氨酸
-5-
半醛脱氢酶
(GSA
两种酶,催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两步反应。
Anoop
等
[4]
成功
地把
P5CS
基因转入水稻中,并发现转基因水稻植株表现为
较好的根生长和较
高的生物量。
1.1.2
甜菜碱甜菜碱
(GB
是生物界广泛存在的细胞相容性物质,
作为
细胞的渗透调节剂,发挥平衡
液泡中水势的功能,并对细胞内大分子物质起保护作
用,从而维持细胞正常的生理功能。
盐胁迫下,水稻细胞中会大量积累
GB
,以维
持细胞内外的渗透平衡,其积累水平与植物抗胁迫能力成正比。其合成途径是由胆
碱经由甜菜碱醛生成甜菜碱,需要胆碱单氧化酶
(CMO
和甜
菜碱醛脱氢酶
(BADH
催化
[5]<
/p>
。
Shirasawa
[6]
用农杆菌将菠菜
(Spinacia oleracea
的
CMO
转化水稻,结果
发现:转基因水稻
GB
含量增加,而且提高了对盐胁迫、温度胁迫的耐受性。
Su <
/p>
等
[7]
制备了几种产
< br>GB
的转基因水稻。在这些转基因水稻中,分别使用了
ABA-
诱
导的启动子
(SIP
和泛素蛋白
(UBI
基因启动子,使胆碱氧化
酶基因
(COX
与叶绿体打
靶序列
p>
(TP
融合表达。发现应用
SIP
的种系的
GB
水平
< br>(2.60μmol/gDW
不如
UBI
种
系的高
(3.12μmol/gDW
。因此,应用
ABA-
诱导启动子在
GB
的初始生产方面并不
合适。但是,
SIP
种系在盐生长环境中提高了
GB
的积累达
89%
,然而
UBI
种系只
有
44%
。尽管
GB
浓度较低,但在统计学上发现,
SIP
种系比
UBI
种系能够产生更
强的胁迫耐受水平,暗示在
SIP
种系中发现的胁迫保护不能完全用所增加的
GB
含
量来解释。而甜菜碱醛脱氢酶
(BADH
对植物细胞中甜菜碱的合成和积累有直接的
作用。
1990
年
Weretilnyk
等
[8]
从菠菜中首次克隆了
BADH
的
cDNA
。郭岩等
[9]
应
用基因枪法将含盐生植物山菠菜
(Atriplex hortensis BADH
基因的植物双元表达
载体
导入粳稻中花
8
号中,得到的转<
/p>
BADH
基因水稻植株具有较高的耐盐性。
1.1.3
糖
醇糖醇作为相容性溶质在渗透调节和渗透保护
中起重要作用。王慧中等
[10]
通过农
杆菌介导法将
1-
磷酸甘露醇脱氢酶
(mtlD
基因,
6-
磷酸山梨醇脱氢
酶
(gutD
基因同
时整合进水稻基因
组并且在转基因水稻中得到表达,气相色谱分析证明转基因水稻
合成并积累了甘露醇和山
梨醇。与未转基因对照相比,转基因植株耐盐性明显提
高。
1.2
功能蛋白相关基因
LEA
基因是在种子成熟和发育阶段表达的基因,称为晚期胚
胎发生丰富蛋白
基因,在种子发育过程中
的胚胎晚期引起
LEA
蛋白的高度富
集。在植物受到盐胁迫后造成脱水的营养
组织中也有所表达。
L
EA
基因表达与植物的环境胁迫成正相关。在胁迫条件下,
LEA
蛋白对植物细胞起保护作用。在
ABA
和盐诱导下,
LEA
蛋白在耐盐的水
稻根
部有积累而在盐敏感品种中没有积累
[11]
。
Xu
等人
[12]
p>
将大麦的
LEA-2
基因
< br>
HV
A1
转入水稻,转基因水稻获得高耐盐性。
< br>钙依赖
/
钙调素不依赖的蛋白激酶
(OsCDPK7
是一种依赖于
Ca 2+
< br>的参与寒冷与
盐胁迫的正向调节因子。已有资料报道
Os
CDPK7
在根的中柱和花冠维管束中大量
表达,同时,该基因
也在花冠维管束鞘以及根的厚壁组织中表达。
Saijo
等<
/p>
[13]
制备
了过量表达
OsCDPK7
基因的转化体,转化体中加入了花椰菜病毒
35S
启动子,证
实了上述结果。
OsbZIP23
是水稻亮氨酸拉链转录因子家族成员之一,为研究其功能和细胞内
的定位,
p>
Xiang
等
[14]
< br>将其转化酵母细胞,发现
OsbZIP23
作为转录激活
因子而发挥
功能。用
OsbZIP23-
绿色荧光蛋白在洋葱
(Allium cepa
细胞中的瞬
时表达确定了该
蛋白在核内的定位。同时还发现,表达
OsbZ
IP23
的转基因水稻表现出对干旱、高
盐很强的耐受性以及对
ABA
的敏感性。而且,该基因的无效突变体对高浓度的
ABA
p>
、高盐和干旱胁迫表现出明显的敏感性降低及耐受性降低,该表型可通过将
< br>OsbZIP23
转导该突变体而得到弥补,暗示其在胁迫耐受的遗传改良方面具
有潜在
的应用价值。质外体蛋白在水稻盐胁迫中也扮演了重要角色。
Zhang
等
[15]
用
200mmol/L
的
NaCl
对
10
日龄的水稻进行处理,然后用二维蛋白质电
泳对抽提的质
外体进行
了分析,发现
其中一个质外体蛋白具有富含半胱氨酸功能域
(DUF26
的胞
外结
构域
——
OsRMC
。该蛋白在盐胁迫的初期对盐胁迫的应答提高非常明显。应用
RNAi <
/p>
技术,确定了其在转基因水稻盐胁迫应答中的功能。结果表明,与非转基因
水稻相比,在转基因水稻中下调
OsRMC
的表达水平能够使种子发芽缓慢、生
长抑制情况得到缓解,同时提高了水稻对
NaCl
盐胁迫的耐受性。
1.3Na
+/H+
反向转运蛋白基因
Fukada
[16]
等首次从单子叶植物水稻中克隆得到了水稻液泡膜
Na
+/H+
逆向运
输蛋白基因
OsNHX
1
。为确
定
OsNHX1
的产物在细胞内的定位
,
Fukuda
等
[17]
利用
OsNHX1
产物的特异
< br>性抗体对其具体定位进行了分析,结果发现
OsNHX1
的表达产物定位于液泡膜,
结果暗示了
OsNHX1
基因编码液泡
(Na+
、
K +/H+
反向转运体。高浓度的
NaCl
和
KCl
处理都可以提高
OsNHX1
在水稻根和地上部的
OsNHX1<
/p>
的转录,
OsNHX1
受
盐和甘露醇处理诱导表达,过量表达
OsNHX1
可以
提高水稻的耐盐性
[17]
。
Ohta
[18]
利用耐盐植物野滨藜
(Atr
iplex fera
的液泡膜逆向转运蛋白
AgNHX1<
/p>
过量表达,
提高转基因水稻的耐盐性。液泡膜上的
OsNHX1
在将
Na
+
以及积累于细胞质中的
K +
运送到
液泡的区室化过程中扮演了重要的角色,说明反向转运体的数量是决定
水稻盐胁迫的重要
因素。
Kader
等
[19]
研究发现
OsHKT2(K+/Na+
共转运
体
和
OsVHA(
< br>盐胁迫下液泡
Na
+/H+
反向转运体的激发器
的诱导
多数发生于韧皮部、韧
皮部到叶肉细胞的过渡部分和叶片的叶肉细胞。邱生平等
[20]
通过
RT-PCR
< br>技术从
水稻幼苗组织中克隆了一个新的
Na +/H +
逆向转运蛋白基因
OsNHX2
,结果
表
明,水稻
2
个液泡膜
Na +/H+
逆向转运蛋白基因
OsNHX2
、
OsNHX1
在盐敏感程度
不同的水稻品种中表达有所不同,液泡膜
Na +/H+
逆向转运蛋白基因的转录调控可
能是决定水稻耐盐能力的一个重要因素。
1.4
其他基因
Katsuhara [21]
p>
将大麦的
HvPIP2;1
基因转入水稻,
得到转基因水稻。
HvPIP2;1
的过量表达提高了水稻根的
保水性达
140%
,茎杆到根的达到<
/p>
150%
。使得生长在
100mmol/
LNaCl
盐胁迫下的
转基因水稻,生长速度大于非转基因植
株。
Hu [22]
通过研究展示了胁迫应答基因
SNAC1
的过量表达明显提高了转基因水稻对干旱的耐受性
(
比对照组的发芽率高
22%~34%
,这些水稻是生长于大田、处于极度干旱胁迫的条件下,且处于发育阶
段,没有
表型变化和产量上的损失。转基因水稻在幼苗期表现出对干旱和盐的耐受
性的明显提高。
SNAC1
主要在保卫细胞中通过干旱诱导表达出来,编码具有
转录
激活活性的
NAM
,
ATAT
和
CUC(NAC
转录因子。
DNA
芯片分析显示,在过量
表达
SNAC1
的水稻中,大量胁迫相关基因表现
出上调。数据暗示
SNAC1
在通过
水
稻对干旱和盐的耐受方面具有良好的应用前景。
2
耐盐相关新基
因的克隆建立盐
胁迫下水稻的
cDNA
文库是筛选盐胁迫相关基因的最佳方法。
Qian
等
[23]
构建了盐
胁迫
下和没有盐胁迫的水稻
cDNA
文库,通过差异筛选得到
p>
3
个盐胁迫应答克
隆,
Ts1
、
Ts2
、
Ts3
这
3
个克隆分别定位于
1
、
3
、
p>
7
号染色体上。
Northern
blotting
分析显示在盐胁迫
3h
< br>内
Ts1
和
Ts2
转录水平提高,并在
24h
内保持高水平,然而<
/p>
Ts3
的转录水平在
3h
内达到高峰。
Rabbani
[24]
等利用干旱、寒冷、高盐处理的水稻植株
cDNA
文库,建立了
cDNA
微阵列,微阵
列中包含了
1700
种
cDNA
p>
。最终他们鉴定了
73
个胁迫诱导基
因,其中包括了
58
个新的未见报道的基因。
其中,第
36
、
62
、
57
和
43
号基因分别是由寒冷、干旱、高盐和
ABA
诱导表达的。发现,
胁迫应答基因的表达有很强的相关性,而且发现了对
上述
4
种处理而应答的
15
个
基因。分析发现,在因干旱、
ABA
和高盐胁迫而产生的信号路径之间有很强的相
关性,该相关性比因寒冷、
ABA
胁迫或寒冷与高盐胁迫所引起的信号相关性强。
同时转录组分析显示,水稻中存在与拟南芥中不同源的胁迫诱导基因。
李子银等
[25]
利用差异显示
PCR(RT-PCR
技术从水稻中克隆了
2
个受盐胁迫诱
导和
1
< br>个受盐胁迫抑制的
cDNA
片段,分别代表了
S-
腺苷蛋氨酸脱羧酶
(SAMDC
基因、水稻翻译延伸因子
1A
蛋白
(eEF1A
基因家族中的新成员
(
称为
REF1A
以及一
个功
能未知的新基因
(
命名为
SRG1
。进一步利用
RT-PCR
技术克隆了
SAMDC
基
因的全长
cDNA
序列
(SAMDC1
,发现该
基因序列与其他植物及酵母、人类的
SAMDC
基因均
有一定的同源性。
Northern
杂交结果显示,
SAMDC1
和
REF
1A
基因的转录均
明显受盐胁迫诱导,而
SRG1
基因的转录在盐胁迫
6h
后即受到抑制。
Southern
杂
交分析表明
SAMDC1
和
SRG1
基因在水稻基因组中均以单拷贝存在,而
REF1A
基
因则检测到多个拷贝。
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