-
pull-down
试验方法
(
自己总结
)
12
、
GS
T
蛋白的表达和纯化
12
、
1
GST
蛋白的表达（
1)
将表达
GST
融合蛋白的质粒转入
BL21
大肠杆菌菌株中。（
2)
挑单克隆于
3ml LA(LB+Amp)
培养基中，37℃摇菌过夜，获得
种子液。（
3)
将种子液稀释于
50ml2XYTA(YTG+Amp)
培养基中，使起始
OD600
为
0
、
1
。（
4)
28℃,220rpm
摇菌培养
2
小时。（
5)
加入
50μl100mM IPTG,16～27℃摇菌培养<
/p>
1
～
8
小时。（
6)
收菌，将菌液倒入大离心管，
2
管
/50ml
菌液，
< br>4
℃5krpmx5min
离心，弃上清。（
7)
加入
10ml PBS/
< br>管，重悬细胞
,5krpm
离心
5min
，弃上清。（
8)
加入
2ml
PBS/
管，重悬细胞。转移至
5ml
离心管。（
9)
超声破壁破壁前，在细胞悬液中加
20μl10mg/ml P
MSF,80μl
蛋白酶抑制剂
(100x)
< br>。破壁参数：
Frequency:100
～
200w
60s
，
pause
20s run40s,5cycles
破至菌体由浑浊变为澄清。加
100μl20%
TritonX
－
100
，冰上放置
30min
。（
10)
将裂解液分入
1
、
5ml
离心管中，4℃离心
12krpm10min
，取上清。（
11)
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吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮
3min
。离心（
12krpm,1min<
/p>
），取上清作
SDS-
PAGE
电泳，检测表
达情况。
12
、
2
准备
50%GST
Sepharose4Bslurry
（
1)
将原
75%Glutathione Sepharose4B
的
slurry
弹至混匀。（
2)
取
677μl
原
液
/
管，
3krpm
< br>离心
5min
，弃上清。（
3)
加
500μl
PBS
，颠倒混匀，
3krpm
离心
5min
，弃上清。反复
5
次。（
4)
加
500μl
PBS
，颠倒混匀，配成
50%Glutathione
Sepharose4B
备用。
12
、
3
GST
融合蛋白的纯化（
1)
在新鲜
制备的细胞裂解液上清中加入
20μl50%Glutathione
Sepharose4B
，4℃，摇床上摇，反应
30
min
～
60min
。（
2)
3krpm
离心
5m
in
，弃上清。该
Sepahrose
上即结合了
GST
融
合蛋白，（如果仅
仅是做纯化效果检测或者蛋白表达量很高，可
以只接合一次，如果要结合更多则接着往下
做）（
3)
在管中加入离心后的
<
/p>
1
、
5ml
新鲜
制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应
30min
～
60min
。
3krpm
离心
5min
，弃上清。重复该步骤多次，就可以使
Sepahrose
上结合
6
～
10ml
裂解液中的
GST<
/p>
融合蛋白。（
4)
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在管中加入预冷的
200μl
PBS
（沿壁加入，小心勿剧烈，以
免打断珠
子与蛋白的联接）
,
轻晃悬浮珠子，将
Sepharose
洗涤一
次，
3kr
pm
离心
3min
，弃上清。（
5)
反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可
以中枪吸，尽量吸净但不吸走珠子），即获得结合有
GST
融合蛋
白的
Sepharose
。（
6)
如果用于检测，在
Sepharose
加入
15
～20μ
l1
蛋白电泳上样
缓冲液，在沸水浴中煮
3min
。
12krpm
离心
1min
，取上清作
SDS-
PAGE
电泳。（
7)
如果
用于
pull
－
down
测试，参见
pull
－
do
wn
步骤。
14
、体外蛋白质结合分析（
GST-
pull down
）（
1)
将结合
有
GST
融合蛋白的
Glutathi
one Sepharose4B
悬浮在
500μlNETN<
/p>
缓冲液中加入
20
～30μl
含有其他蛋白的溶液，例如
pET
发酵的产物
,
细胞表达的产物等，同时采用结合有
GS
T
空蛋白
的
Glutathione
Sepharose4B
平行操作作为对照。（
2)
在水平摇床上，
4
晃动
4
～
8
小时。（
3)
离心（
3
< br>、
6krpm,2min
）。吸去上清，注意不要扰动底
层的
Sepharose
、（
4) <
/p>
加入
200μl
缓冲液
< br>H
对
Sepharose
进行洗
涤。注意加入缓冲
液
H
时要贴壁加，不
要直接冲击
Sepharose
，随后轻柔晃动，使
Sepharose
重悬即可。（
5)
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