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各种酶切位点的保护碱基
酶不同，所需要的酶
切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出
碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
3
个
在资料上查不到的，我们一般都随便加
3
个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切
（
Cleavage Close to the End
of DNA Fragments
（
oligonucle
otides
）
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，
NEB
采用了一系列含识别序列的
<
/p>
短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在
多接头
上切割位点
很接近时），或者
当切割位点靠近
常需在识别位点两端至少加上
32<
/p>
DNA
末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通
6
个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
0.1A
260
单位的寡核苷酸。取
1 Q <
/p>
实验方法：用
Y
[
P]ATP
在
T4
多聚核苷酸激酶的
作用下标记
已标记了的寡核苷酸与
20
单位的内切酶，在
20°
C
条件下分别反应
2
小时和
20
小时。反应缓冲液
含
70 mM
Tris-HCI
（
pH
7.6
）
, 10 mM MgCI
2
, 5 mM DTT
及适量的
NaCl
或
KCI
（视酶的具体要求而
定）。
20%
的
PAGE
（
7
M
尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现
发夹结构而降低。
切割率
%
1
酶
寡核苷酸序列
链长
2 hr
20 hr
Acc I
G GTCGAC C
CG
GTCGAC CG
CCG GTCGAC CGG
8
10
12
8
10
12
8
10
12
8
10
0
0
0
0
>90
>90
>90
>90
>90
50
>90
0
0
0
0
>90
>90
>90
>90
>90
>90
>90
Afl III
CACATGT
G
CCACATGT GG
CCC ACATGT GGG
GGCGCGCC
AGGCGCGCC T
TTGGCGCGCC AA
Asc I
n
Ava I
CCCCGGG G
CC CCCGGG GG
TCC CCCGGG GGA
12
>90
>90
BamH I
CGGATCC G
CG GGATCC CG
CGC GGATCC GCG
8
10
12
8
10
12
8
10
12
9
22
24
27
8
8
10
12
8
10
12
8
10
12
8
10
12
8
10
12
8
10
8
14
10
>90
>90
0
75
25
0
0
50
0
0
25
25
0
0
>90
50
>90
>90
>90
>90
>90
>90
0
0
10
0
>90
>90
0
25
0
50
25
>90
>90
0
>90
>90
0
0
>90
10
0
50
>90
0
0
>90
50
>90
>90
>90
>90
>90
>90
0
0
75
0
>90
>90
0
50
0
75
、
Bgl II
CAGATCT G
GAAGATCT TC
GGA AGATCT TCC
-
BssH II
GGCGCGC C
AG GCGCGC CT
TTG GCGCGC CAA
BstE II
BstX I
G GGT(A/T)ACC C
AACTGCAGAA
CCAATGCATTGG
AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA
CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT
Cla I
CATCGAT G
GATCGAT C
CC ATCGAT GG
CCC ATCGAT GGG
j
--
EcoR I
G GAATTC C
CG
GAATTC CG
CCG GAATTC CGG
-
Hae III
GG GGCC CC
AGC GGCC GCT
TTGC GGCC GCAA
Hi nd III
CAAGCTT G
CC AAGCTT GG
CCC AAGCTT GGG
Kpn I
GGGTACC C
GG GGTACC CC
CGG GGTACC CCG
Mlu I
GACGCGT C
CGACGCGT CG
Nco I
CCCATGG G
CATG
CCATGG CATG