基因测序(PCR常见问题)

基因测序（

PCR

常见问题）生物专业很实用< /p>

PCR

常见问题

PCR

常见问题分析及对策

(

无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性

)

问题

1

：无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无

原因

:

1.

模板

:

含有抑制物，含量低

对样品不合适

3.

引物设计不当或者发生降解

< /p>

4.

反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

对策

:

1.

纯化模板或者使用试剂盒提取模板

DNA

或加大模板 的用量

2.

更换

< br>Buffer

或调整浓度

3 .

重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物

< br>

4.

降低退火温度、延长延伸时间

问题

2

：非特异性扩增

现象：条带与预计的大小不一致或者非

特异性扩增带

原因：

1.

引物特异性差

2.

模板或引物浓度过高

3.

酶量过多

2+

浓度偏高

5.

退火温度偏低

6.

循环次数过多

对策：

1.

重新设计引物或者使用巢式

PCR

2.

适当降低模板或引物浓度

3.

适当减少酶量

4.

降低镁离子浓度

5.

适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6.

减少循环次数

问题

3

：拖尾

现象：产物在凝胶上呈

Smear

状态 。

原因：

1.

模板不纯

不合适

3.

退火温度偏低

4.

酶量过多

、

Mg

2+

浓度偏高

6.

循环次数过多

对策：

1.

纯化模板

2.

更换

Buffer

3.

适当提高退火温度

4.

适量用酶

5.

适当降低

dNTP

和镁离子的 浓度

6.

减少循环次数

问题

4

：假 阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

原因：

靶序列或扩增产物

的交

*

污染

对策：

1.

操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；

2.

除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管< /p>

及加样枪头等均应一次性使用。

3.

各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存

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PCR

引物设计的黄金法则