-
--
A/O
法活性污泥中氨氧化菌群落的动态
与分布
摘要
:
我们
研究了在厌氧—好氧序批式反应器（
SBR
)
< br>中氨氧化菌群落
(
AOB
)
和亚硝酸
盐氧化菌群落
(
< br>NOB
)
的结构活性和分布。在研究过程中
,
分子生物技术和微型技术
被用于识别和鉴定这些微
生物。污泥微粒中的氨氧化菌群落结构大体上与初始的接
种污泥中的结构不同。与颗粒形
成一起，由于过程条件中生物选择的压力
,
AO
Ｂ的
多样性下降了。
DGGE
测序表明，亚硝化菌依然存在
,
这是因为它们能迅速的适应
固定以对抗洗涤行为。
DGGE
更进一步的
分析揭露了较大的微粒对更多的
AOB
种类
在反应器中的生存有好处。在
S
Ｂ
R
反应器中有很多大小不一的微粒共存，颗粒的
直径影响这
A
Ｏ
B
和
NOB
的分布。中小微粒（直径
<0
．
6
ｍ
m
）不能限制氧在所有
污泥空间的传输。大颗粒
(
直径
>
０．
9mm<
/p>
）可以使含氧量降低从而限制
N
Ｏ
B
的生
长。所有这些研究提供了未来对Ａ
OB
微粒系统机制可能性研究的支持。
<
/p>
关键词
:
氨氧化菌
(
A
Ｏ
B
）
，污泥微粒
,
菌落发展，微粒大小
,<
/p>
硝化菌分布，发
育多样性
?
简介
<
/p>
在浓度足够高的条件下，氨在水环境中对水生生物有毒，并且对富营养化有贡
献。因此
,
废水中氨的生物降解和去除是废水处理工
程的基本功能。硝化反应
,
将氨
通过硝
化转化为硝酸盐
,
是去除氨的一个重要途径。这是分两步组成的
，由氨氧化
和亚硝酸盐氧化细菌完成。好氧氨氧化一般是第一步
,
硝化反应的限制步骤
:
然而
,
这是废水中氨去除的本质。对
16S
ｒ
RNA
的对比分析显示，大多数活性污泥里
的氨
氧化菌系统的跟
?
-
变形菌有关联。然而，一系列的研究表明
,
在氨氧化
菌的不同代
和不同系有生理和生态区别
,
而且环境因素例如处理常量
,
溶解氧，盐度
< br>,
pH
，自由
氨例子浓度会影响
氨氧化菌的种类。因此
,
废水处理中氨氧化菌的生理活动和平衡
对废水处理系统的设计和运行是至关重要的。由于这个原因
,<
/p>
对氨氧化菌生态和微
生物学更深一层的了解对加强处理效果是必须
的。当今
,
有几个进阶技术在废水生
物
处理系统中被用作鉴别、刻画微生物种类的有价值的工具。目前
,
分子生物技术
的应用能提供氨氧化菌群落的详细分类说明。
--
--
如今，主要由于其细胞固
定策略，好氧污泥颗粒处理已经成为传统废水处理的
替代工艺。颗粒有更加彻底的紧密结
构和快速适应速率。因此，颗粒污泥系统比传
统活性污泥法有更高的混合悬浮固体浓度浓
度（
MLSS)
和更长的污泥龄（
S<
/p>
Ｒ
T)
。更
长的
污泥龄能提供足够长的时间让时代时间长的微生物生长
(
例如氨
氧化菌
)
。有些
研究表示
,
硝化颗粒可以在富铵离子废水中培养出来
,
并且颗粒的直径很小。其他研
究报告说
,
大直径颗粒已经在序批式反应器（
SBR)
中人工合成的有机废水里培育出
来了。污泥颗粒里的大量不同微生物共存，并去除
COD
和氮磷。然而，对于直径
大于
0.6
ｍ
m
的大颗粒来
说，由于氧传递被限制不能到达颗粒核心，外部好氧壳和
内部厌氧地带共存。这些特性表
明
,
大颗粒污泥内部环境不适合氨氧化菌的生长。
有些研究表明，颗粒大小和密度导致了氨氧化菌、亚硝酸氧化菌和反硝化菌的分布
和优势种群。虽然不少研究力求评估废水处理系统中氨氧化菌的生态生理，但是至
今
仍然被污泥颗粒化过程的水力学、分布、氨氧化菌群落的数量化限制着。
?
?
原理和方法
反应器设置和操作
污泥颗粒被接种在
有效体积为
4
Ｌ的实验室规模的
S
Ｂ
R
里。反应器有效直径
< br>和高度分别为
10cm
和
51c
m
。水力停留时间设为
8h
。来自全尺
寸污泥处理设置
(
中
国天津污水处理厂
)
的活性污泥被作为反应器的种污泥
,
其
MLS
Ｓ初始浓度为
38
７
6mg/L
。反应器操
作６小时为一循环
,
由
2
分钟的进水时间，９
0
分钟厌氧混合
,
24
０反正抛弃阶段和
5<
/p>
分钟出水阶段组成。在２
0
天
8
０个Ｓ
BR
循环后
,
污泥沉降时
间逐渐从１
< br>0
分钟降到
5
分钟
,
并且只有沉降速度大禹
4.5m/
ｈ的颗粒才能在反应器
中停留。入流中的主要化合物包括
NaA
ｃ（４
50mg/L)
，ＮＨ
4
C
ｌ
(1<
/p>
０
0mg/L)
，
(N
Ｈ
４
)
2
SO
4
（１
0mg/L)
,
Ｋ
H
< br>2
PO
4
（
2
０
mg/L)
,
MgSO
４
·
7H
2
O(
５
0mg/L
），
KC
ｌ（
20
ｍｇ
/L)
，
Ca
Ｃｌ
2(2
０
ｍ
g/L)
，
< br>Fe
Ｓ
O
4
·
7H
2
O
（
1mg
／
L)
，
pH
７
.0-7.
５
,
a
ｎｄ
0
．
1
ｍ
g
／
L
元素
示踪剂。
分析方法－
T
ＯＣ、
T
Ｎ、Ｔ
P
、
MLSS
、
S
Ｖ
I
都根据标准方法定期检测。
污泥大小分布由筛法决定。
4
个干净的直径为５
cm
钢制筛，筛孔直径分别
0
．
9,0.6
，
0.4
５，和０
.
２
m
ｍ
,
这
4
个筛子被全程监控。用友刻度的圆柱从反应器
中取
100mL
的污泥，然后放到０
.9
ｍｍ筛孔的筛子上。随后用蒸馏水冲洗，直径
--
--
小于
0.
９
mm
的颗粒通过这个筛子，到达筛孔更小的筛子上。冲洗过
程要重复几次
,
以分开污泥团。不同面上收集到的颗粒恢复用蒸
馏水反冲洗。每一部分都手机在不
同的烧杯里，然后用量化的滤纸过滤来测定
TSS
。一旦留在各个筛子上
T
< br>Ｓ
S
的数
量确定了
,
就可以确定不同大小的颗粒占污泥总重的比例了。
?
DNA
提
取和
PC
Ｒ－
DGGE
来自大约
8mg
的ＭＬ
SS
种的污泥被转化成１
.5m
Ｌ的Ｅｐ<
/p>
pend
ｏｒ
f
管
,
然后
在
1
400
０
g
条件下离心
10
分钟。移除上清液，向其中加入１ｍ
L
磷酸钠缓冲液
,
然
后在无
菌条件下研磨以分离颗粒。使用
E.Z
．
N.A.S
ｏｉ
l
D
Ｎ
A
工具，离心物种
DN
Ａ染色体被分离。
为了放大氨氧化菌特征１
6s
ｒ
RNA
来进行
DGGE
，一个巢式
P
Ｃ
R
被用为先前
描述。
3
０
?
ｌ的巢式
PC
Ｒ放
大剂被加载并被在聚丙烯酰胺凝胶上的加了线性分布
为３
5%<
/p>
－５
5%
的变性剂
DGGE
分开。这个胶体在维持
60
度、
14
０
V
、
1×T
Ａ
E
缓冲
液中
(
通用突变检测系统
)
运行
6.5
ｈ。电泳
结束后
,
银染色和胶体的发展表现正如
San
ｇ
uin
ｅ
t
ｔｉ所表述。接下来是空气干燥和用凝胶成像分析系统扫描。凝胶扫
描图像用Ｑ
u
ａ
nti
ｔ
y
O
ｎｅ分析
，版本号
4
．
31
。成对群落相似性的色子指数是计
算评估氨氧化菌群落在
D
GGE
中线路相似性的。这个用Ｑ
u
ａ
ntity
Ｏ
ne
< br>测出的指数
范围从
0%
（无共同
频带
)
到
1
０
0%(
频带相同）。
Shanno
ｎ多样性指数（
H
）是用来
衡量将一个菌群中每个菌种的丰富度和比例加入考虑的微生物多样性。
H
用下列等
式计算：
其中，ｎ
i
／
N
表示
i
菌种占总群落的比例
(i
条带亮度在条带总亮度中的比例
)
。
微生物系统树图模板相似性使用
Quant
ｉ
t
ｙ
One
不用非加权配对组算术平均
数（
UPGMA
法）算法就能计算出来。
突出的
D
ＧＧ
E<
/p>
条带被切除并溶解在
30mL
Ｍ
ill
ｉ
-Q
水中过夜
,
温度维持
4
摄
氏度。在冷冻解冻３次后凝胶中的
DNA
被回收。目标
DNA
片段的克隆
及测序按照
既定的方法
(
Zha
ｎ
g
等，
201
０
)
进行。
?
硝化细菌的分布
为了调查
AO
Ｂ和
NOB
在颗粒中
的空间分布
,
3
种大小
([0
．２
-
０
.45],
［
0.45-
０
.6
］，
>0.9 mm
）的颗粒在第
180
天被选定做
FISH
分析。
2m
ｇ的污泥样品
被固定
--
--
在在４摄氏度下的
4
%
多聚甲醛溶液
16-
２
4
h
< br>，然后用磷酸钠缓冲液冲洗两次；样
本分别在在
5
０
%
，
80%
和
1
００
%
的乙醇中脱水
10
分钟。在室温下，将颗粒在乙
醇—二甲苯体积比分别为
3:1
，
1:1
,
１
:3<
/p>
然后
1
０
0
％二甲苯的溶液中连续浸泡
,
每
次
10
分钟后，颗粒中的乙醇然后完全被二甲苯取
代。随后，将颗粒在二甲苯与石
蜡体积比为
1
< br>：
1
的６
0
度溶液中浸泡
30
分钟，接着再在
1
０
0
％石蜡溶液中浸泡
30
分钟，颗粒被石蜡嵌入。在石蜡固化后，切为８
mm
厚的片
,
放置在涂了明胶的
显微镜上。将切片在二甲苯和乙醇中各浸泡
30
分钟
,
石蜡被去除，然后将切片干
燥
。
三个寡核苷酸探针被用于杂交
:<
/p>
FI
ＴＣ标记为
Nso190
,
指明了大多数
A
Ｏ
B
；
TR
Ｉ
TC
标记为
NI
Ｔ<
/p>
3
，指明了硝化
sp
。所有的探针序列
,
杂交条件，以及洗涤条件都
在表
1
中给出。寡核苷酸的合成以及荧光标记都来
自
T
ａ
ka
ｒ
a
公司。
杂交是在包含了各个标记了的探针
(5ng
< br>?/L
）的
46
摄氏度度杂交缓
冲液
(
０
.
９
M Na
Ｃ
l,
甲酰胺的百分比见表
1
，
2
０
mM
Tr
ｉｓ
/
Ｈ
Cl
,
ｐ<
/p>
H
值
8.0
，<
/p>
0.0
１
%
<
/p>
Ｓ
DS)
下进行了
2
小时。杂交后
,
未被结合的寡核苷
酸由一个严格的洗涤步骤去除
:
在
48
度与洗涤液含有相同化合物的缓冲液中洗涤
15
分钟。
为了所有
DNA
的探测，Ｄ
API
被用甲醇最终稀释到浓度
为
1ng
?
／
L
。将切片
用Ｄ
A
Ｐ
-
Ｉ
emetha
ｎｏ
l
覆盖并保持恒温<
/p>
3
７度１
5
分钟
。然后将切片用甲醇清洗
一次，再用蒸馏水简单清洗，完了立刻空气干燥。使用Ｖ
ectas
ｈ
ie
ｌ
d
（媒介实验
室
)
以防止照片变白。使用激光共聚焦显微镜来抓拍杂交图像（
CLSM,
Ｚ
eiss
７
10
）。
每种颗粒大小的每个探头都各自一共拍了
10
张图像。最后使用
Ad
ｏ
be
Ph
ｏ
t
ｏ
Sh
ｏ
p
选出代表图像和最终图像的评价。
表
1
:
用于不同大小颗粒的寡核苷酸探针
--
--
图１：生物量和Ｓ
VI
10
在整个操作过程中的变化
?
?
结果
<
/p>
Ｓ
BR
性能及颗粒特征
< br>
在启动阶段
,
反应器能高效去
除
TO
Ｃ以及氨氮。
9
８％的氨氮和１
0
０
%
的
TOC
分别在第
3
天和第
5
天从入流中被去除
(
图
S2
，
S3)
。这一期间总氮和总磷的去除率
不高，虽然总
磷的去除率逐渐提高
,
在第
33
天达到
10
０
%
（图
S4)
。
<
/p>
为了确定污泥颗粒的污泥体积指数，沉淀时间由
10
分钟代替３
0
分钟
,
因为颗
粒污泥在６０分钟和５分钟后有一个相似的Ｓ
< br>VI
数值。接种污泥的
S
Ｖ
I
值是１
08
．２
Ml/g
。在连续操作中
M
Ｌ
SS
和Ｓ
VI
10
的变化如图１所示。污泥沉降性在设置
阶段
明显提升。图
2
反应了污泥颗粒的慢速形成，从流动态到颗粒状
态。
?
Ｄ
G
ＧＥ技术分析
:
AO
Ｂ的群落结构在污泥颗粒化中的变化
巢式
PCR
的结果在图Ｓ
1<
/p>
中显示。在Ｇ
SBR
的操作中，较好显示
的
DGGE
条带
被在代表性点上得到，
那些条带揭示
AOB
群落的结构在污泥颗粒化和稳定化过程
中是动态的（图
3
）。实验结束时的菌群结
构与初始接种污泥的菌群结构是不同的。
AOB
群落在第一天和
G
Ｓ
BR
操作
的最后仅有
40%
的相似度
,
指明接种污泥和形成的
颗粒污泥中
AOB
群落有重大变化。通过计算
Shan
ｎ
on
指数Ｈ分析
D
Ｇ
GE
模板得
出的生物多样性见图
5
．
--
--
图
2
：污泥中颗粒大小分布在操作过程中的变化
图
3
：
AOB
群落在污泥颗粒化过程中
DGGE<
/p>
分析
(
顶部表示取样时间
)
。主要条带已
用数字标出
(
条带
1
－
15
)
--