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细胞冻存
Cell
Cryopreservation
细胞复苏
+
冻存的操作原则：快速融化，缓慢冷冻（速融慢冻）
“
速融慢冻
”
原理详见《细胞复苏
protocol
》
【细胞冻存的背景
+
原理】
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各
种准备
工作方面都需大量的耗费细胞，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它
的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条
件
的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻
< br>储存在
-70
℃
冰箱中可以保存
一年之久；
细胞储存在液氮中，
温度达
-196
℃
，
理论上储存时间是无限的
。
细胞冻存的原理是细胞在
-70
℃
以下时，细胞内酶活性停止，代谢处
于完全停止状态，故可以长期保存。
细胞三个状态分期
·
详见《细胞传代<
/p>
protocol
》
【细胞冻存加入冻存保护剂的原因】
在不加保护条件下直接冻存细胞时，
细胞内和外环境中的水会形成冰
晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解
质浓度升高、渗
透压改变、脱水、
pH
值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡。但如向
培养基中加入保护剂（甘油或
DMSO
）
，可使冰点降低，在缓慢降温的冻<
/p>
存条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
储存在
-130
℃
以下低温中能加速水冰晶的形成。
溶解细胞时，
速度要
快，
使之迅速通过细胞最易受损的
-5
～
0
℃
后，
细胞仍能生长，
活力不受任
何损害。
当前使用的保护剂为
DMSO
和甘油，
它们对细胞无毒性，
分子量
< br>小，溶解度大，易穿透细胞，使用浓度范围在
5
～
10
％之间，常用
10
％。
【细胞冻存时速率要求】
为保护细胞最大存活率，
一般采用
“
速融慢冻
”
的方法
。
标准的冻存降
温速度为
-1
～
-2
℃
/min
；当温度达
-25
℃
时，
下降率可增至
-5
～
-10
℃
/min
；
到
-100
℃
时则可迅速浸入液氮中。
要适当掌握下降速度，
降温速度过快能
影响到细胞
内水分透出，太慢则促进冰晶形成。
但不同的细胞对冻存速度的要求不一样，
上皮细胞和成纤维细胞的对
< br>降温速率的耐受性大一些，骨髓干细胞
-1
～
-3
℃
/min
较合适，
胚胎细胞耐
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受性较小。总之，在一开始时下降速度不能
超过
-10
℃
/min
。
另外，用什么保护剂合
适和用量多大，要依细胞而定，初代培养用
DMSO
较好，一般
细胞可用甘油。用量以较小为好，有人认为人皮肤上皮
细胞储存在
20~30%
甘油中很好。原则上细胞在液氮中可储存多年，但为
妥善起见，冻存一年后
，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。
【细胞冻存时具体方法】
（
1
）使用程序降温盒
最常使用的是
Nalgene
的程序降温盒，降温速率为
1
℃
/min
（
2
）传统方法
传统的方法是将细胞依次置于
4
℃
、
-20
℃
、
-80
℃
保存，
最后再放置到液
氮槽中长期保存。
①
标准程序：
将细胞冻存管放入普通样品收纳盒中：
当温度在
-25
℃以上时，
1~2
℃
/min
；
当温度达
-25
℃以下时，
5~10
℃
/min
；
当温度达
-100
℃时，可迅速放入液
氮中；
②
简易程序：
将冻存管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，
< br>通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降
1~2
℃的速度，
在
40
min
内降至液氮表面过夜，次晨投入液氮中。
③
传统程序：
冻存管置于
4
℃
10
分钟→
-20
℃
30
分钟→
-80
℃
16~18
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小时（或隔夜）
→
液氮罐长期储存。
【细胞冻存时间科学安排】
进行大批
细胞冻存时，
因细胞培养皿数量较多，
故需对时间进行科学安排
：
①
细胞
冻存管需提前标记好（冻存管较小，且管身和管盖均需标记，故
需要较长时间，实验间隙
无法完成）
，提前标记好，可以从容进行实验；
②
实验开始前，
就要配制好双倍浓度的
DMSO
溶液，
因
DMSO
溶解于培
养基时会放热
；若不充分降温，会对细胞产生损伤；
③
因常用的
Nalgene?
程序降温盒有
18
个
孔，
因此一次最多可以同时冻存
18
管
细胞，按照
1:2
的冻存比例，一次操作的上限是
9
盘细胞；
以一次冻存
9
盘细胞为例：
④
先从培养箱中取出
3
盘细胞消化，利用等待消化的时间，再取出
3<
/p>
盘
进行消化；接着将第
1
批处理的
3
盘细胞终止消化，加入完全培养基后放
在超净台内待用；再等待数分钟终止第
2
批
处理的细胞的消化，如上述方
法处理；最后再消化剩余的
3
盘细胞；
⑤
<
/p>
细胞冻存悬浮液加入冻存管的方法——先加
500μ
L
的细胞悬浮液，再
加等体积的双倍浓度
DMSO
溶液；
因为要尽量避免细胞在冻存保护剂
中停
留的时间；
根据经验，冻存一个
程序降温盒（
18
管）
，用时约
1
小时；冻存细胞是精
细实验，不需要刻意追
求速度，只在最后加细胞冻存保护剂时略快即可；
【细胞冻存的几点注意事项】
01.
细胞冻存前一天可以安排换液，以期冻存时细胞状态最好；
<
/p>
02.
细胞冻存时一般以汇合度
90%<
/p>
为宜；
03.
细胞冻存也有细胞扩增的目的，
冻存时以
1:2-1:4
之间的比例进行
冻存
（即每
< br>10cm-dish
对应冻存
2-4
管细胞）
；
①
考虑到细胞复苏后的状态（一般细
胞复苏后尽量减少生长时间，尽快
传代或使用）
，推荐
1:2
的比例进行冻存；
②
以实验室常用的
Nalgene?
Mr.
Frosty,
Cryo
1
℃
Degree
Freezing
C
ontainer
梯度降温（程序降温）冻存盒为例，其内有
1
8
个孔。故一般扩
增细胞的培养方式为复苏
1
管，
1:3
传至第
2
代，再
1:3
传至第
3
代，共
9
盘细胞
，按照
1:2
的方式冻存，恰好为
18
管；
04.
提前
1
天标记好细胞冻存管；
因细胞冻存管（常使用
Corning
公司<
/p>
1.5ml
冻存管）体积较小，故标记时
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耗时较长。标记时，冻存管盖及冻存管身均要标记，如下图所示；
需标记的基本信息有：
细胞系名
称
+
扩增批次，细胞来源（名称后代码）
，冻存日期，细胞冻存保
护剂（
DMSO
）比例，冻存者姓名；
以冻存
18
管（
9
盘，
1
个程序降温盒）
293T
细胞实验为例
【细胞实验超净台前的准备】
准备事
项同细胞传代
protocol
中同步骤
【细胞冻存操作步骤】
01
确认拟冻存的细胞冻存管已标记好；
02.
打开水浴锅，
将培养基、
TE
和
PBS
用封口胶封好后水浴至
37
℃
；
03.
检查及准备细胞程序降温盒；
①
首先检查程序降温盒的使用次数，
如超过
5
次，则需更换异丙醇；
②
异丙醇有毒性，更换时除需做好防
护措施外，更换过程需在通风橱内
进行；丢弃的异丙醇需抛弃至废液桶内集中处理，不得
直接倾倒；
③
如程序降温盒是临时从
-80
℃冰箱取出
< br>（前
1
天冻存过细胞）
，
则先将程
序降温盒内的细胞放入液氮后，再把降温盒放入
37
℃水浴锅提前复温；
④
添加异丙醇辅助降温的原理：
异丙醇
易挥发，并且容易吸收空气中的水分，所以在冷冻细胞的过程中可
以辅助实现缓慢降温，
直接从室温放进
-80
℃时，
可以达到近似于
-1
℃
/min
；
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