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现代液相色谱技术进展概述
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色谱法最初仅仅是作为一种分离手段，
是根据混合物中不同组分在流动相
和固定相间具有不同的分配系数
,
当两相作相对运动时，
这些组分在两相间进行反复多次的
分配，从而得到分离。直到五十年代，人们才开始把这种分离手段与检测系统连接起来，
成为一种独特的分析方法，是几十年来分析化学中最富活力的领域之一，也是生命科学和
制备化学中广泛应用的一种手段。
色谱的
发明者，俄国植物学家
，是在研究植物色素的过程中，
于
1906
年创立这种简易的分离技术，奠定了
传统色谱法基础。从此之后，化学家、生物化
学家和生理学家们在制备高纯化合物、分离
和鉴定复杂混合物时便有了一条崭新的有效途
径。自从有了这种手段，使许多过去被认为
是单一的物质，判明却是多种化合物的混合物；
许多化学反应的过程依靠这种方法而得以
探讨；终于使许多复杂混合物，例如维生素、药
物、色素、氨基酸等得到离析；这种方法
甚至帮助科学家们了解了一些长期模糊不清的自
然现象，诸如植物与动物的营养、激素对
人和动物的生理特性、维生素在动植物体中的分
布等等问题。
T
swett
的实验意义很大，尽管他于
1907
年在德国柏林植物学会议上反复强
调色谱技术，
但并
没有受到当时科学界的重视。
经过二十五年后，
德籍奥地利化学
家
等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去
一个世纪以来公认为单一的结
晶状胡萝卜素分离成
a
和
b
两个同分异构体，并由所取得的
纯胡萝卜素确定出了其分子
式。另外他还发现了八种新的类胡萝卜素，并把它们制成纯品
，进行了结构分析。同年，
他又把注意力集中在维生素的研究上。
在确定了维生素
A
的结构以后，
于
1933
年从
35000
升脱脂牛奶中分离出一克核黄素（即维生素
B2
），
制得结晶，并测定了它的结构。此外，
他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌
鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确
定离析出来并制成结晶。
Kuhn
正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重
大研究成果而获得了
1938
年诺贝尔化学奖，
也正因为他的出色工作使色谱法名声大振，
迅
速为
各国科学家们所注目，广泛被采用起来。
1
液相色谱固定相
1.1
正相色谱
八十年代初，
人们使用的正相色谱固定相硅胶和吡啶硫氰酸镍盐的络合物晶
体能与芳香族化
合物形成包合物用于分离芳香族含氮异构体和胆甾醇晶体。
已有人
[1]
将焦
炭吸附剂作为填料和键合硅胶作过比较并研究其热
力学机理。具有离子化或非离子化功能
团的大孔聚合物也开始应用于液相色谱，这些聚合
物在整个酸碱范围内稳定，其中一个缺
点是当溶剂改变时，它们会热胀冷缩，但是其主要
的分析方面用途，即从水中收集痕量研
究化合物是没有问题的，通过适当的处理装入色谱
柱，一些物质出现过度的峰带变宽
，而
另一些则出现尖、窄的峰带和高分离度，在强碱性大孔树脂中
120
< br>分钟内可分离
100
种尿
液中
紫外吸收物质
[2]
。
有人将各种链长
度的碳氢配位体键合到硅胶上，
根据链长短效应研
究保留值的影
响，也有过类似的报道，将
C22
键合相以及制备键合相担体
各种条件作过比
较，其键长度和吸附自由能成线性关系。一般地，碱溶液会破坏硅胶，烷
基胺比季铵盐更
会腐蚀硅胶填料，故通过加填有
5m
m
硅胶的短预柱来洗脱碱性溶液。
K
ataev
等
[3]
用聚三
氟苯乙烯涂成的硅胶微粒基质并应用到卤代芳烃、多肽和蛋白质的分离。
1
993
年
11
月，
Majors
讨论了在日本发展迅速的
HPLC
聚合物填料。
Hosoya
制备了大
孔聚合乙烯—对—
叔丁基苯甲酸丁酯微球和两种别的聚合物微球的性能以及更多的
C18HPLC
固定相。
1.2
反相色谱
< br>固定相的研究进入九十年代更是热火朝天。
这方面的研究报道远远超过流动
相的研究，人们不断探索保留过程及相关烷基键结构的复杂性和可能制得的各种新型固定
相。
Bolok
和其合作者从统计技术研究
反相色谱柱的老化过程。
Montes
等评价了一种硅氢
化物介质的硅氢烯制备烷基键合相，
更早时候基质制备可供参考。<
/p>
Moriyama
等评价了用
2mm
硅胶制得的
TSK
胶
Super ODS
新型反相色谱柱的特性，他们论述了如何分离手性化合物。
Schmid
与合作者论述了含饱和脂肪酸
键合相的合成与性质，并且与相应的饱和烃固定相的
使用作过比较。
Pesek
和
Matyska
合成
了两种不同的二醇键合相，包括一种是“可靠的”，
另一种通过将
7
－辛烯－
1
，
2
－二醇直接连接到氢化硅基质上。
Jino
和
Nakamura [4]
评
< br>价了用氟处理的键合硅胶作为一种反相色谱基质与常规反相色谱基质的选择性不同。
Buszewki
等比较了烷基胺和烷基键合相基质用于反相分离，
发现前者对分离极性化合物效
果显著，但其热稳定性不如后者。
Wongyai
用苯丙醇胺键合到硅胶上产生离子交换——反
相基质的混合模型，并且评价了酸性系列、中性和碱性物质的分离效果。
Fri
ebe
将
Calixarene
键合
到硅胶上研究其作为选择相能够形成类似于环糊精的内包合物。
Chriswanto
和伙伴们将聚吡咯相涂在硅胶上作为
HPLC
的特征化填料。
Ge
等合成了聚
3
－
辛环吡咯改性硅胶，
评价其作为
蛋白质的分离及探讨酸、
碱介质的稳定性。
Skapo
和
Simpson
则在流动床中制得反相基质，
他们总结出在有机溶剂中通过这种途径与常规键合相比较可
制得重现性更好的基质。
Theinpont
论述了在
HPLC
柱中已经填装好的硅胶的衍生化过程
和通过这种途径制得的色谱
柱和常规键合相色谱柱进行了比较。
1.3
亲和色谱
日本和欧洲较多研究多孔聚
合物在液相色谱中的应用，
这些聚合物可用于分
离各种芳香族化
合物和糖类，高分子填料对保留值有较大影响，依据不同溶剂洗脱次序，
可估算出聚合物
溶解度参数。它们适用于亲水溶质排阻色谱，如有一种吸附剂
TSK-SW
硅
胶带有亲水键合相，在较大的流速下能经受高压且有非常高的分离度，尤
其适用于蛋白质
和腐殖酸的分离。曾有人描述过带羟基、氰基、铵离子及芳基金属醚键合
到硅胶上，铵离
子键合相主要以氢键结合，通过溶剂作用稳定保留值。
< br>
1.4
离子交换色谱
离子交换固定相的确研究过不少，如八十年代初流行的
TSK
型
SW
硅胶
及基于二
乙胺乙基
(DEAE)
制成的阴离子交换材料用于蛋白质及核
酸的优化分离，
低聚糖的
分离采用
Mi
cro-Pak AX-5
。
XAD
树脂是色谱中使用最基本的固定相，弱酸、弱碱及两性电
解质的分离均有人研究过，反离
子以扩散双电层形式存在。也有人制备多孔甲基丙烯酸盐
离子交换剂，但多数人愿意使用
商品化的交换剂。
Sevec
和
Frechet [5]
制得聚甲
基丙烯
酸缩水甘油酯共聚二甲基乙烯丙烯酸酯色谱柱
(300×8 mm) 用于蛋白质离子交换的制备
色谱。
他们能做到一次进样到这种色谱柱分离
300mg
的蛋白质混合物。
Gawdzrk
和
Matynia
制备了一种交联的
(p,p’—二羟基苯
)
—丙烷二环氧甘油醚和二乙烯苯的甲基
丙烯酸酯的
多孔共聚物作为一种最新的
HPLC
填料并且评价了其作为正相和反相分离的效果。
Danielson
和其合作者
[6]
用一种丙胺基硅基质同
Kel-F800
反应制得一种弱阴离子交换
填料。
1.5
空间排阻色谱
Kato
等曾通过丁醚或三乙醇苯醚与
TSK G3000 SW
空间排阻色谱法
(SEC)
结合合成
HIC
固定相材料，当使
用盐溶液梯度洗脱时，可达到很高的分离度。一些
极性键合相通过分配比调节的排阻色谱
分离蛋白质和多肽。
Miller
等报道过用醚相结构合
成大孔硅胶填料：
Si-(CH2)3-O-(CH2CH2O)n
-R;n=1,2
或
3;R=Me,Et
或
n-Bu
。
用这种填料制
得的色谱柱可至少连续使用五个月其保留值不变。
烷基链长度和配体密度能直接影响到保留值与分离度，
而使用低配位数密度基质更易
再生，
不易变性，对分离大多数蛋白质来说，基质微球直径在
3
00? 时具有最强的再生力，直径
小到
1mm
的多孔微粒填入
1cm
的色谱柱中对于蛋白质的分离
十分有用。另一改进色谱有效
途径是使用非多孔微球
(1-3m
m)
，
柱长约
30mm
，柱效稳定，当小心控制流动相温度和所有
仪器组成
时，柱外效应很小，曾有人通过洗脱法在
2
分钟内分离
6
种蛋白质的混合物。
Smigol[7]
论述了均相聚合甲基丙烯酸缩水甘油酯共
聚乙烯二甲基丙烯酸酯微球用特殊化
功能的多孔介质制得二醇或二乙胺相有较大孔隙和十
八烷基官能团有较少孔隙，这样制得
的一种基质当所有分子接近极性相时，较少的分子进
入多孔介质，而限制了大分子进入到
十八烷基键合相中。
总之，不论是何种类型的固定相对于手性异构体的拆分以及蛋白质和多肽大分子的分离仍
在不断的探索完善之中，从发展的趋势看，寻求各种高分子材料作为新型色谱固定相前景
光明。
2
液相色谱流动相
液相色谱应用广泛的
是反相色谱，其流动相的优化组合直接关系到分离效果。八十年代二
元流动相组成优化依
赖于容量因子(k’)的对数值与极性溶剂的摩尔分数关系，
根据两者线
性关系，
可以估算溶质的保留值。
曾有人确定过
14
种二元溶剂系统的容量因子与流动相的
关
系。
Scott,Snyder
和<
/p>
Soczeuinski
的色谱模型被应用于分离烷基酚和萘酚，
使用
m
Bondapak
NH2
固定相，
Nurok
和
Richard
建立了一个简单的方程来确
定溶剂组成的优化，这种方法既可
以用于
TLC
也可以用于
HPLC
。六种等离子强度溶剂的结合被应
用于产生六种三元流动相，
用于分离大范围的化合物，
这些混合
物的极性通过增加极性溶剂来调节。
Zima
和
Smolkova
报道过在碳吸附剂上氨基酸保留值的酸碱效应及离子强度，并
且给出一系列方程式预言这
些两性电解质的保留行为。
Mark
l
曾将有机磷和硫加入到流动相中可以调整硅胶表面，这
些化合
物吸附在硅胶表面由于氢键作用而改变了选择性和溶质的保留值。
Hitachi
化学公
司用于二甲基乙烯酰胺和二甲基聚丙烯酰胺流动相用无机酸调
节
PH
2
-6
来分析
PI2550
使
用二乙烯苯
—苯乙烯作填料，曾获得专利。
Cole
和
Dorsey
研究过在反相分离梯度洗脱过
程中二次平衡保
留时间问题，他们发现当加入
3
％
1-
丙醇到强溶剂和弱溶剂中去时，二次
平衡时间大大缩短。在反相
分离过程中，曾有人作过三种研究关于分配过程中热力学驱动
力。
Sentell
和
Henderson
研究过
C18
相作为温度和键合密度形状选择性并且发现低
于室
温和高键合密度固定相可获得较好的选择性，他们建立了范德荷夫座标图并且指出作
为一
种功能键合密度图形的差异。
G
heong
和
Carr
曾使用对于烷基
苯在水和
4
种最普通的有机混合溶剂的一系列无限稀溶液
的活度系数的混合物中，观测其保留过程。他们注意到非极性溶质在饱和的十六烷甲醇溶