-
CRISPR/Cas9
基因敲除技术
CRISPR/Cas9
（
Cluster
ed Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
）
是一种由
RNA
指导的
Cas9
核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。
CRISPR/Cas9
是细菌和古细菌为
应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御
机制。
目前
，
来自
Streptococcus
pyogenes
的
CRISPR-
Cas9
系统应用最为广泛。在这一系
统中，
crRNA
（
CRISPR-derived RNA
）
通过碱基配对与转录激活
crRNA
（
trans-activating RNA
，
tracrRNA
）退火结合形成双链
RNA
能特异性识别基因组序列
，
< br>Cas9
蛋白（含有两个核酸
酶结构域，
可以分别切割
DNA
两条单链。
Cas9
首先与
crRNA
及
tracrRNA
结合成复合物，
然后通过
PAM
序列结合并侵入
DNA
< br>，形成
RNA-DNA
复合结构，进而对目的
DNA
双链<
/p>
进行切割，
生成
DNA
双链断裂
（
double-
strand breaks, DSBs
）
。
在基因组编辑过程中，
tracrRNA
和
crRNA
可以融合成为
1
条
RNA
（
sgRNA
）表达同样可以起到靶向剪切的作用。
通过基因工程手段对
crRNA
和<
/p>
tracrRNA
进行改造，将其连接在一起得到
sgRNA
（
singleguide
RNA
）。融合的
RNA
具有与野生型
RNA
类似的活力，但
因为结构得到了简
化更方便研究者使用。通过将表达
sgRNA
的原件与表达
Cas9
的原件相连接
，得到可以同时
表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
由于
PAM
序列结
构简单（
5
’
-NGG-3
’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，
因此得到广泛的应用。
与锌指核酸酶（
ZFNs
）和转录激活样效应核酸酶（
Transcription
act
ivator-like effector
nucl
eases,
TALEN
）相比较，
C
RISPR-Cas
系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相
似甚至更高的效率。
CRISPR/Cas9
系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基
因
修复等。
CRISPR-Cas9
体系的
RNA-DNA
识别机制为基
因组工程研究提供了一项简便而
强大的工具。其最重要的优势是
Cas9
蛋白可在多个不同的
gRNA
的引导下同时靶向多个基
因组位点，起到多靶点调控的作用。
起源：
1
、
2007
年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的
食品添加剂公司，目前
被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力
的方法。
2
、
2013
年，四个研究团队报告了这一被称为
CRISPR<
/p>
的系统，自此
CRISPR
技术红红
火火的发展了起来，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、<
/p>
细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。
3
、
2015
年，蒙大
拿州立大学的两位学者以
―CRISPR
-RNA-
Guided
Adaptive
Immune
Systems‖
为题，介绍了
CRISPR-
Cas
免疫应答系统。
其中
Blake Wiedenheft
就是当年加州大学伯克利分校
Jennifer Doudna
研究组成员，
他们
曾于
2010
年破解了
Csy4
核糖核酸内切酶原子水平
的晶体结构模型
——
研究人员确定
Cs
y4
是一种存在于原核细胞的酶，它能够启动生成
CRISPR
衍生
RNAs
(crRNAs)
，这种小
RNA
分子能够靶向并沉默侵入的
病毒和质粒。
CRISPR
与
RNAi
的区别
目前已经广泛应用的
RNAi
技术的
靶标是
mRNA
，
而
< br>CRISPR
通过
RNA
识别
DNA
序列
然后再改变
DNA
序列，是可以遗传的。由于编码
mRNA
的
DNA
序列只占总
DNA
的极少
部分，因此靶向
DNA
序列的
CRISPR
的靶标要比
RNAi
广得多，更有可能筛选出针对某
DNA
序列的特异
CRISPR
靶标。
CRISPR/Cas9
特点和缺点：
CRISPR/Cas9
的优点是操作简单，
< br>对基因组的效率高。
需要对某一个靶位点编辑的时候，
只
需要表达相应的
sgRNA
即可，
不需
要对
Cas9
核酸酶进行改造。
它可对
任何物种的基因组
进行高效率的定向编辑。
1
、操作简单，靶向精确性更高。
<
/p>
sgRNA
靶向序列和基因组序列必须完全匹配，
Cas9
才会对
DNA
进
行剪切。编码
sgRNA
的
序列不超过
100bp
，
因此比构建
TALENs
和
ZENs
更简单方便，
用于
CRISPR
的<
/p>
sgRNA
识别序
列仅需
20
个核苷酸。
2
、
CRISPR/Cas9
系统是由
RNA
调控的对
DNA
的修饰，其基因修饰可遗传。
3
、基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等
4
、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
< br>
5
、无物种限制。
6
、实验周期短，最快仅需
2
< br>个月，节省大量时间和成本。
基因组编辑技术的一个缺
点是脱靶效应，可能在靶点以外的地方切断
DNA
，产生
indel
。
CRISPR-
Cas
系统三个主要阶段
细菌和古细
菌进化出了复杂的
CRISPR
适应性免疫系统，这一系统可以
分成
I-III
三个类型
，
至少有
11
种不同的亚型
：
从
I-A
到
I-F
，从
II-A
到
II-C
，以及
III-A
和
III-B
。其中Ⅰ类和Ⅲ类需要
多种
CRISPR
相关蛋白（
Cas
蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种
Cas
蛋白即可，这
为其能够广泛应用提供了便利条件。
<
/p>
不过尽管有这些不同，
所有的
CRISP
R-Cas
系统都通过三个主要阶段来完成功能：
采集，
CRISPR RNA(crRNA)
生物合成，靶向干扰。
阶段
1
：外源
DNA
采集
外源核苷酸是通过
< br>Cas
蛋白来识别的，入侵的短片段
DNA
（
30-50
个碱基对）被称为
protospacers
，
作为间隔序列插入宿主
CRISPR
位点中，
由重复序列隔开。
对于
I
型和
II<
/p>
型系
统来说，
protospacers
来自入侵
DNA
中两侧出现
2-5
个核酸结构
（
PA
M
，
protospacer adjacent
motif
）的区域。一般
protospace
rs
连接在
CRISPR
位点的一端
，并且后者通过涉及
Cas1
、
Cas
2
和游离
3’
-hydroxyls<
/p>
等元件的机制，
牵引序列。
Protos
pacer
的整合过程中也出现了牵引
末端重新序列复制，这可
能涉及宿主聚合酶和
DNA
修复机制。
相关论文解析：
Multiple
mechanisms for CRISPR
–
Cas
inhibition by anti-CRISPR proteins
研究人员确定了其中三种
anti-CRISPR
蛋白：
AcrF1
、
Acr
F2
和
AcrF3
的功能机制。他
们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究，
证实每一个
anti-CRISPR
蛋白都通过不同的机制
来抑
制了
CRISPR
–
Cas
的活性。有两个
anti-CRISPR
阻断了<
/p>
CRISPR
–
Cas
< br>复合物的
DNA
结
合活性，
但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作，
利用了空间或非空间抑制模
式来做到这一
点的。第三种
anti-CRISPR
蛋白通过结合
Cas3
解螺旋酶
< br>-
核酸酶，阻止其招募到结合
DNA
的
CRISPR
–
Cas
复合物上来起作用。在体内，这一
anti-CRISPR
可以将
CRISPR
–
Ca
s
系统转
变为转录遏制物，
首次证实了
一种蛋白质相互作用蛋白可以调控
CRISPR
–
Cas
活性。
作者们
认为，
这些
anti-CRISPR
蛋白质不
同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在
其他的方式
—
蛋白质借助于它们改变了
CRISPR
< br>–
Cas
的功能。
新研究首次探讨了蛋白质抑制
CRISPR
–
Cas
系统的机制。
这些多样且不同的机制
反映了
病毒
-
宿主军备竞赛深层的进化
根源。这些已知和尚有待发现的
Anti-CRISPR
，将为
认识和
操控
CRISPR
–
Cas
系统提供大量有价值的工具。
其中一个例子
就是，
新研究发现
AcrF3
通过
阻止招募
Cas3
将
CRISPR
–
Cas
系统转变为了
一个基因调控因子。由于除了破坏外源
DNA
，
CRISPR
–
Cas
系统来
执行着各种功能，
许多重要的功能有可能是由与
CRISPR<
/p>
–
Cas
元件互作，
由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。
生物谷推荐的
英文原文
SnapShot
：
CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune
Systems
阶段
2
：
crRNA
合成
CRISPR
RNA
生物合成在转录
之后，生成初级转录产物：
pre-crRNA
，之后经过加工
，
又成为一组短小的
CRISPR
衍
生
RNAs
（
crRNAs
）
，这些
crRNAs
每
一个都包含有对应于之
前遇到的外源
DNA
的对应序列。
CrRNAs
导向
序列两端是相邻重复序列区域，在
I
型和
II
型系统中，这种
CRISPR
转
录
产物会被
CRISPR
特异性核酸内
切酶（
Cas6
或
Cas5d
）切割，切割位点位于重新序列。许
多
I
型系统的重新序列会出现多次，因此
Ca
s6
也需要稳定连接在
crRN
A 3
’
端茎环上。对于
III
型系统来说，
Cas6
则是短暂连接，
crRNA
3’
端会进一步通过未知的酶处理。
II
型系统中，
CRISPR
RNA
加工过程则取决于反式作用
crRNA
(tracrRNA)
，
tracrRNA
包含一个重复序列的互补序列，这些双螺旋区
域在
Cas9
出现时可以通过
RNas
e
III
进行处
理。
相关论文解析：
CRISPR-mediated
adaptive immune systems in bacteria and
archaea
.
这篇发表在
Annu. Rev. Biochem.
杂志上的文章十分重要，解析了
crRNA
合
成过程，以
及其后的靶向干扰中的几个重要步骤，此后也被多人引用。
< br>
Development and applications of
CRISPR-Cas9 for Genome Engineering
张锋的这
篇综述概述了
CRISPR/Cas9
作为一种平台技术的开发
状况以及在基因组编辑
方面的应用，也讨论了其存在的一些挑战，以及未来的创新之路。
阶段
3
：靶
向干扰
成熟的
crRNAs
能指导
Cas
蛋白靶向互补靶标，
靶标序列由专用
Cas
核酸酶降解，但其
靶标降解的机制存在差异。
I
型和
II
型系统都可以靶向包含
PAM
和
protospacer
互补序列的
dsDNA
底物。
III
型系统则
不依赖于
PAM
作为识别序列，而是
通过导向序列延伸至
crRNA
信号
5
'handle
的核苷酸进行识别（
CRISPR
位点包含与导向序列，
5'handle
互补的序列
）
，并
阻止靶向切割。
相关论文解析：
Co-transcriptional
DNA
and
RNA
Cleavage
during
Type
III
CRISPR-
Cas
Immunity
一些数据
表明，当病毒入侵细菌细胞时，称作为
III
型
CRISPR-Cas
的这一机制会靶向
病毒的
DNA
，阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。但另外
的一些实验表
明，
III
型
CRISPR-Cas
只能通过切割病毒
RNA<
/p>
来让病毒丧失能力。
洛克菲勒大学的研
究人员他们检测了
III
型
CRISP
R-Cas
对
DNA
和
RNA
的切割，结果
发现了从前其他人没有得到过的一
个关键成分，并发现
CRISPR-Cas
确实切割了病毒
DNA
生成的
RNA
，但它也切割了病毒的
DNA
。
<
/p>
这种双交叉系统有一些优势。
许多的病毒整合到它们感染细胞的基
因组中保持休眠状态，
不会造成损伤。
事实上，
这些病毒对于细菌可能是有益的，
例如它们携带的毒素帮助了细菌
促进自身生存。
举例说来，
白喉毒素是由一种细菌所
分泌，
但编码这一毒素的基因却来自于
一种病毒。只有在病毒开
始将它们的
DNA
转录为
RNA
之时才会让它们丧失功能，通过设
置这样的要求
III
型
CRISPR-
Cas
不会损及休眠病毒，使得它们可以继续让宿主细菌受益。
循环关闭
I
型系统中，监测复合物中靶向结合会导致
Cas3
介导的靶向降
解（直接干扰）或最初
采集，这其中涉及
crRNA
导向募集
Cas3
、
Ca
s1
和
Cas2
到外源
DNA
处，引起新一轮的快
速采集。
II
型系统中虽然未观察到最初采集，
但
Cas9
也是
prot
ospacer
筛选的必要元件，
这表明
在靶向干扰与外源
DNA
采集之间存在一种功能性联系。近期
还有研究发现了编码
anti-CRISPRs
蛋白的不同病
毒基因，指出了干扰以上不同阶段，能颠覆
CRISPRs
系统。
Cas9
specifies functional viral targets during CRISPR-
Cas adaptation
.
一些证据表明，某些
Cas
酶（未包括
Cas9
< br>）自身可以操控记忆形成过程。基于
Cas9
识
别切割位点的方式，研究人员猜测
Cas9
在记
忆形成中也发挥了作用。
除了匹配
C
RISPR
引导序列和病毒
DNA
，<
/p>
Cas9
需要在附近寻找第二信号：病毒
DNA
中的
前间区序列邻近基序
(
protospacer adjacent motif
，
P
AM)
序列
。这是一个至关重要的步
骤
，因为
PAM
序列的存在阻止了
Cas
9
攻击细菌自身包含记忆的
DNA
。<
/p>
为了检验他们的假说，研究人员交换了化脓链球菌和嗜热链球菌
免疫系统的
Cas9
酶，
它们各自识别
不同的
PAM
序列。
结果，
PAM
序列跟随着在两种细菌之间发生了交换
——
表
明
在记忆形成中
Cas9
负责了
PAM
的识别
。
Multiple
mechanisms for CRISPR
–
Cas
inhibition by anti-CRISPR proteins
实验操作
1
、根据靶序列设计
RNA
序列；
设计
sgRNA
，提供的序列经过
blast
，优选脱靶效应最低，此外，为进一步提高
sgRN
A
的特异
性和降低脱靶效应，提供双切口
sgRNA
对设计（
Figure1
）。
Figure
1.
Schematic illustrating DNA double-
strandedbreaks using a pair of sgRNAs guiding Cas9
D10Anickases (Cas9n).
2
、
sgRNA
表达载体构建，或
< br>sgRNA
体外转录合成
A<
/p>
、
sgRNA
表达载体构建
（试剂盒
Precut SgRNA Cloning kit &pSD-
gRNA Plasmid
）
质粒
pSD-gRNA
专门用于在哺
乳动物细胞中表达
sgRNA
，
该质粒
含
CMV
启动子驱动的
GFP
报告基因表达框，
与
Cas9
表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。
此质粒含氨苄
抗性用于阳性克隆筛选，
试剂盒提供预剪切线性质粒，
可以直接进行连接筛选阳性克隆，
降
低了酶切质粒不完全导
致假阳性克隆的出现几率。
B
、
sgRNA
体外合成。
sgRNA
合成纯化试剂盒（
T7
sgRNAMICscriptTMKIT&EzOmicsTMRNA QUICK clear KIT
）
体外转录的
sgRNA
< br>与质粒表达的
sgRNA
相比，
更简便快捷，
省去了质粒构建的步骤，
整个操
< br>作过程仅需
20h
（包括过夜孵育）。转录纯化后的
sgRNA
可直接进行转染及细胞显微注射。
（
1
）
s
gRNA
合成引物（反向引物设计为固定模式）
（
2
）
PCR
kit
（
e.g. pfu DNA
polymerase
）
（
3
）
T7
sgRNAMICscriptTM KIT
（
4
）
EzOmicsTM RNA QUICK clear
KIT-------
一步纯化
RNA
转录产物
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