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分子标记技术简介
分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，
是
< br>DNA
水平遗传多态性的直接的反映。
与其他几种遗传标
记——形态学标
记、生物化学标记、细胞学标记相比，
DNA<
/p>
分子标记具有的优越性有：大
多数分子标记为共显性，
对隐性的性状的选择十分便利；
基因组变异极其
丰
富，
分子标记的数量几乎是无限的；
在生物发育的不同阶段，<
/p>
不同组织
的
DNA
都可用于标记分析；分子标记揭示来自
DNA
的变异；表现为
中性，
不影响目标性状的表达，
与不良性状无连锁；
检测手段简单、
迅速。
随着
分子生物学技术的发展，
现在
DNA
分子标记技术已有数十种，
广泛应用于
遗传育种、基因组作图、
基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基
因克隆等方面。
分子标记的概念有广义和狭义之分
。
广义的分子标记是指可遗传的并
可检测的
DNA
序列或蛋白质。
狭义分子标记是指能反映生物个体或
种群间
基因组中某种差异的特异性
DNA
片段。
理想的分子标记必须达以下几个要求：
(1)
具有高的多态性；
(2)
共
显性遗传，
即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；
(3)
能明
确辨别等位基因；
(4)
遍布整个基因组；
(5)
除特殊位点
的标记外，
要求
分子标记均匀分布于整个基因组；
(6)
选择中性
(
即无基
因多效性
)
；
(7)
检测手段简单、
快速
(
如实验
程序易自动化
)
；
(8)
开发成本和使用成本尽
量低廉；
(9)
在实验室内和实验室间重复性好
(
便于
数据交换
)
。
但是，
< br>目
前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】
一、基于分子杂交技术的分子标记技术
此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物
DNA
分子，然后用经标记的特异
DNA
探针与之进行杂交，通过放射自显
影或非同位素显色技
术来揭示
DNA
的多态性。
①
限制性片段长度多态性
(Restriction
Fragment Length
Polymorphism
，
RFLP)
1974
年
Grodzicker
等创立了限制性片段长度多态性
(RFL
P)
技术，
它
是一种以
DNA
—
DNA
杂交为基础的
第一代遗传标记。
RFLP
基本原理：
利用
特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组
DN
A
，
得到大小不
等的
< br>DNA
片段，
所产生的
DNA<
/p>
数目和各个片段的长度反映了
DNA
分子
上不
同酶切位点的分布情况。
通过凝胶电泳分析这些片段，
就形成不同带，
然
后与克隆
DNA
探针进行
Southern
杂交和放射显影，即获得反映个体特异
性的
RFLP
图谱。它所代表的是基因组
DNA
在限制性内
切酶消化后产生片
段在长度上差异。
由于不同个体的等位基因之
间碱基的替换、
重排、
缺失
等变化导致
限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片
段长度的差异。
RFLP
的等位基因其有共显性特点。
RFLP
标记位点数
量不受限制，通
常可检测到的基因座位数为
1
< br>—
4
个。
RFLP
技术也存在一些缺陷，
主要是
克隆可表现基因组
DNA
多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，
检测周期长，成本费用也很高。自
RFLP
问世以
来，已经在基因定位及分
型、
遗传连锁图谱的构建、
疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
②
数目可变串联重复多态性
(Variable Number
of Tandem
Repeats
，
VNTR )
数目可变串联重复序列又称小卫星
DNA
(Minisatellite
DNA)
，是一
种重复
DNA
小序列，
为
10
到几百核苷酸，
拷贝数
10
一
10001
不等。
VNTR
基本原理与
RFLP
大致相同，
只是对限制性内切酶和
DNA
探针有特殊要求：
(1)
限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫
星序列的完整性。
(2)
内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可
使卫星序列所在片段含有较少无关序列，
通过电泳可充分显示不同长度
重
复序列片段的多态性。
(3)
分子杂
交所用
DNA
探针核昔酸序列必须是小卫
星序列或微卫星序列，
通过分子杂交和放射自显影后，
就可一
次性检测到
众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的
DNA
指纹图谱。
小卫星标记的多态信息含量较高，
在
17
一
19
之
间。
缺点是数量有限，
而且在基因组上分布不均匀，
这就极大限制其在基因定位中的应用。
VNTR
也
存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。
二、基于
PCR
技术的分子标记技术
（一）、随机引物的
PCR
标记
所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的
DNA
区域事先未知。随
机引物
PCR
扩增的
DNA
区段产生多态性的分子基础是模板
DNA
< br>扩增区
段上引物结合位点的碱基序列的突变，
不同来源的
基因组在该区段上表现
为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。
随机引物
PCR
标记表现为显
性或
共显性。
①
随机扩增多态性
DNA (Random Amplified
Polymorphism DNA
，
RAPD
)
RA
PD
技术是
1990
年由
Wiliam
和
Welsh
等人利用
PCR
技术发展的检
测
DNA
多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为
8
—
10bp
）
通过
PCR
反应非定点扩增
< br>DNA
片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物
DNA
片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的
DNA
多态性。
RAPD
所使用的引物各不相同，
但对任一特定引物，它在基因组
DNA
序列
上有其特定的结合位点，
一旦基因组在这些区域发生
DAN
片段插人、
缺失
或碱基突变，
就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，
从而导致扩
增产物数量和大小发生改变，
表现出多态性。
就单一
引物而言，
其只能检
测基因组特定区域
DNA
多态性，
但利用一系列引物则可使检测区域扩大到
整个基因组，因此，
RAPD
可用于对整个基
因组
DNA
进行多态性检测，也
可用于
构建基因组指纹图谱。
与
RFLP
相比，
RA
PD
具有以下优点：
(1)
技术简单，
检测速度快；
(2)
RAPD
分析只
需少量
DNA
样品；
(3)
不依赖于种属特异性和基因组结构，
一
套引物可用
于不同生物基因组分析；
(4)
成本较低。
但
RAPD
也存在一些缺
点：
(1)
RAPD
标记是一个显性标记，不
能鉴别杂合子和纯合子；
(2)
存在
共
迁移问题，
凝胶电泳只能分开不同长度
DNA
< br>片段，
而不能分开那些分子
量相同但碱基序列组成不同的
DNA
片段；
(3)
RAPD
技术中影响因素很多，
所以实验的稳定性和重
复性差。
②
任意引物
PCR (Arbitrarily Primed
Polymerase Chain
Reaction
，
AP
—
PCR)
在
AP<
/p>
—
PCR
分析中，所使用的引物较长
(10
－
50 bp)
，
PCR
反应分
为两个阶段，
首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板
DN
A
退火，
此时发
生了一些合成，
以便稳定模板与引物之间相互作用。
然后进行高严谨退火
条件的循环，
两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸
可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析
PC
R
产
物，最终反应结果与
RAPD
类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能
减少引物产生人为产物
，应用成对组合的引物可以产生新的
AP
—
PC R
谱
带，
但引物配对组合使
用时，
得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱
之和很不相同
，这样，
50
个引物能产生
1250<
/p>
种不同指纹图谱。
AP
—
PC
R
方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，
还
能够用于检测近等基因系
(
或同类系
)
中的多态性。
AP
—
< br>PCR
的缺点是每
个新的多态性都必须经纯化才能进一步
使用。
另外，
此方法在杂合体中仅
可辨
别长度多态性。
③
DNA
扩增指纹印迹
(DNA
Amplification Fingerprinting
，
DAF)
DAF
是一种改进的
RAPD
分析
技术，与
RAPD
技术不同的是，
DA
F
分析
中所使用的引物浓度更高，长度更短
(
一般为
5
一
8 bp)
，因此它所提供
的谱带信息比
< br>RAPD
大得多，如当使用
5
个
核昔酸的引物时，引物和模板
的组合大约可扩增出
10
一
100
个
DNA
片段。
PCR
扩增产物是在凝胶上进
行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。
（二）、特异引物的
PCR
标记
特异引物的
PCR
< br>标记所用引物是针对已知序列的
DNA
区段而设计<
/p>
的，具有特定核苷酸序列（通常为
18
—
24
bp
），可在常规
PCR
复性温度
下进
行扩增，对基因组
DNA
的特定区域进行多态性分析。
①
序列标志位点
(Sequence Tagged
Sites
，
STS)
STS
是
对以特定对引物序进行
PCR
特异扩增的一类分子标记的统称。
通过设计特定的引物，
使其与基因组
D
NA
序列中特定结合位点结合，
从而
可
用来扩增基因组中特定区域，
分析其多态性。
利用特异
PCR
技术的最大
优点是它产生信息非常可靠，
而不像
RFLP
和
RAPD
那样存在某种模糊性。
②
简单重复序列
(Simple Sequence
Repeat
，
SSR)
简单重复序
(SSR)
也称微卫星
DNA
，其串
联重复的核心序列为
1
一
6
bp
，其中最常见是双核昔酸重复，即
(CA)
n
和
(TG) n
每个微卫星
DNA
的
核心序列结构相同，
< br>重复单位数目
10
一
60
个，
其高度多态性主要来源于
串联数目的不同
。
SSR
标记的基本原理：
根据微卫星
序列两端互补序列设
计引物，
通过
PC
R
反应扩增微卫星片段，
由于核心序列串联重复数目不同，
因而能够用
PCR
的方法扩增出不同长度的
PCR
产物，
将扩增产物进行凝胶
电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
SSR
具
有以下一些优点：
(l)
一般检测到的是一个单一的多等位基因
位点；
(2)
微卫星呈共显性遗传，故
可鉴别杂合子和纯合子；
(3)
所需
D
NA
量少。
显然，
在采用
SSR
技术分析微卫星
DNA
多态性时必须知道重复序列
两端的
DNA
序列的信息。
如不能直接从
DNA
数据库查寻则首先必须对其进
行测序。