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重组酶介导的核酸快速扩增法
摘
要
：<
/p>
体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技
术。重组酶介导的扩增
(recombinase-aid amplificati
on,RAA)
技术是在现有体
外核酸扩增原理的基础上发展起
来的恒温体外快速扩增核酸技术。
RAA
法利用重
组酶、单链结合蛋白和
DNA
聚合酶代替了传统
PCR
的热循环解链过程
,
实现了在
37
℃恒温下的核酸快速扩增，有望在不远的将来取代传统的热循环<
/p>
PCR
反应。
Abstract
:
Nucleic
acid amplification is a biotechnology that trace
nucleic acid can be
rapidly amplified
in vitro
. Recombinase-aid
amplification (RAA) is the
most recent
isothermal
amplification technology, in which the classical
thermal
stable enzyme
has been replaced by
recombinase,single-stranded DNA binding (SSB) and
DNA
polymerase. Therefore, the RAA
reaction can be carried out at
optimized37°
C or under
the
room temperatures without any heating assistance.
These merits could largely
facilitate
RAA more applicable than PCR in the near future.
关键词：
重组酶
体外核酸扩增
在过去１０年中，若干恒温核酸扩增技术得到快速发展
[1]
，如
SDA
技术、
TM
A
技术、
HDA
技术、
LAMP
技术和
RPA
／
RAA
技术等。
本文介绍的重组
酶介导扩增
(r
ecombinase-aid
amplification,RAA)
技术是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方<
/p>
法。
与
RPA
不同的是
,
RAA
扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶
[2]
。
在
37
℃恒温下
,
该重组酶可与引物
DNA
紧密结合
,
形成酶和引物的聚合体，
当
引物在模板
DNA
上搜索到与之完
全互补的序列时，在单链
DNA
结合蛋白
(singl
estrandedDNA
binding,
SSB)
的帮助下，
使模板
DNA
解链，
并在
DNA
聚合酶的
作用下，形成新的
DNA
互补链。反应产物也是以指数级增长，通常在
1
h
内即
能得到可以用琼脂糖凝胶电泳
检测到的扩增片段
[3]
，整个反应简单快速，因为不
需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
1
材料与方法
1.1
蛋白和
DNA
天蓝色链霉菌重组酶蛋白
(SC-
recA)
和枯草芽孢杆菌重组酶蛋
(BS-recA)
分别
来自天蓝色链霉菌和枯草芽孢杆菌
.
将天蓝色链霉菌、
枯草芽孢杆菌重组酶基因分
别克隆至
pET21a
表达载体中，
过量表达后用
Ni-NTA
亲和层析纯化，
< br>并用
Bradfo-
rd
法定量。重组
DNA
是
rnd
基因编码区的一部分
(310
bp)
，将此片段连接到载
体上，
转化大肠杆菌获得含重组
DNA
的菌
株
(Top10)
。
1.2
RAA
扩增
将含有目的片段的大肠杆菌
Top10
菌株过夜培养，从中取出
1 mL
菌
液，
100
℃加热
10
min
。冷却至室温，从中取出
1
μ
L
作为扩增模板。引物
A
、
B
大小
分别为
34
和
32
nt
。反应体系如下：
50 pmol
引物
A
；
50pmol
引物
B
；
1 mmol/L
dNTP
；
90 ng/μL SSB
蛋白；
120ng/
μ
L recA
重组酶蛋白
(SC-recA/BS-
recA)
；
30
ng/
μ
L Bsu DNA
聚合酶；
反应缓冲液
(100
mmol/L Tricine
，
pH
8.0
；
100 mmol/L
醋酸镁；
5mmol/L
二硫苏糖醇；
5%PEG
20K
；
2.5 mmol/L
ATP
；
100
ng/
μ
L
肌
酸激酶
)
。摇匀后放置于
37
℃培养箱温浴
1
h
。
取
10
μ
L
反应产物经酚
< br>/
氯仿提纯
后，
在
1.5%
琼脂糖凝胶上电泳。
2
结果与分析
在细菌或真菌
DNA
复制过程中，重组酶蛋白起着重要的作用。重组酶蛋白
可与单链
DNA
结合而阻止细胞核内核酸酶对单链
D
NA
的降解，在
DNA
重组过程
中，
重组酶还负责基本的碱基配对
[4]
。当然，在体内，还会有其他辅助性蛋白，
如
recB
，
recC
和单链
DNA
结合蛋白等，共同参与到
DNA
的重
组中。因此，在
进行核酸体外扩增时，重组酶蛋白无疑是起着决定性作用的反应催化剂。
为了验
证重组酶的作用，
设计了有针对性的
RAA
扩增体系，
除了
SC-r
ecA
、
BSrecA
重组
酶外，还加入了
DNA
聚合酶和辅助蛋白
Bsu
等。
实验结果表明，在目前的反应体系中，含有
SC-recA
和
BS-recA
重组酶的反
应体系都可以正确扩增出目的片段，说明
SC-recA
和
BS-recA
重组酶均具有催化
功能，而且反应的特异性很高。扩增的目的片段长
310
bp
，是之前克隆到载体里
的
rnd
基因编码区的一部分。
3
讨论
3.1
重组酶蛋白在
RAA
反应中的作用
重组酶都能够与
DNA
紧密结合，这
是使核酸体外扩增反应顺利进行的关键
一步。在体外核酸扩增体系中，重组酶蛋白的作用
是帮助
DNA
模板的解链和促
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