-
实验室内部的人胚胎干细胞
protocol
人类胚胎干细胞
H1
和
H9
维持方案
一、试剂配制
饲养层细胞培养基
Fibroblast-DMEM Media (F-DMEM)
DMEM
(GIBCO
11960-044)
450ml
FCS
GIBCO 16000-044
50ml
10%
Pen/Strep
2.5ml
50IU/ml
L-glut
GIBCO 25030-081
5ml
2uM/ml
人类胚胎干细胞培养基
HESC-
Media
KO-DMED
GIBCO 10829-018
480ml
KOSR
GIBCO 10828-028
120ml
20%
10mM NEAA
GIBCO 11140-050
6ml
0.1mM
L-glut(0.2M)
GIBCO 25030-081
6ml
2mM
Pen/Strep
3ml
55mM BME
GIBCO 21985-023
1.1ml
0.1mM
ITS
GIBCO 41400-045
6ml
4-80C
避光保存。用前每
50
毫升加
200
-400ng bFGF
细胞冻存培养基
FBS-DMSO
FCS
GIBCO 16000-044
9ml
90%
DMSO
SIGMA D2650
1ml
10%
细胞消化液
Trypsin-
EDTA
0.25%
Trysin-1mM
EDTA
GIBCO
25200-056
0.05%,0.2mM
PBS(-)
14190-144
8ml
MEF
细胞有丝分裂终止液
Mito C
Mitomycin C
0.2mg
0.05mg/ml
dd-H2O
15230-162
4ml
避光保存。
Mito C
的终浓度为
10ug/ml
即
40
吸
ul
工作液加到
2ml
F-DMEM
中。
.
0.1%
Gelatin(
用于培养皿的包被
)
1% Gelatin
40ml
0.1%
2ml
ddH2O
GIBCO 15230-162
360ml
高压消毒。
二、
培养方案
一
)
饲养层细胞的培养
1
、主要实验材料
< br>（
1
）培养液为
F-DMEM<
/p>
。
（
2
）小鼠
周龄为
7
～
8
w
的性成熟母小鼠和周龄为
8w
的种公
鼠。
2.
小鼠胚胎成纤维细胞
(MEF)
的培养
（
1
）小鼠胚胎的准备
1)
性成熟母小鼠与种公鼠按
1
< br>公（
♂
）
:2
< br>母（
♀
）比例合笼。
2)
每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物
(
阴道栓
)
即确定为怀孕
。见栓当
天上午定为怀孕的
0.5d
。
3)
取怀孕
12.5
～
14.5d
母鼠
,
断颈处死，无菌条件下暴露子宫。
4)
用镊子提起近子宫颈端
,
分离子宫系膜
,
剪断子宫角。
<
/p>
5)
取出整个子宫
,
在无菌滤纸上吸干血迹
,
置于有
P
BS
或无血清
DMEM
平皿内。
用
PBS
洗涤
三次<
/p>
,
弃除表面残余血迹。
6)
沿子宫系膜侧剪开子宫
,
取出带有胎膜的胚胎
,
置于另一盛有
P
BS
或无血清
DMEM
平皿内
,
充分洗涤
,
弃除表面
红细胞。
7)
用小镊子撕破胎膜
,
取出胎鼠
,
弃除
胎膜
,
用
PBS
洗涤三次。
8)
去除胚胎头部、<
/p>
内脏和四肢，
将躯干部置于另一盛有
PB
S
或无血清
DMEM
平皿内
,
用
PBS
至少洗涤三次
,
充分弃除红细胞。
（
2
）小鼠胚胎成纤维细胞
(
MEF)
的培养
二
)
培养方法有两种
:
组织块培养法和单细胞悬液培养法。
组织块培养法：
1)
用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪
(
切
)
成
1mm3
以下
的碎块
,
吸
置于离心管内。
2)
室温下静置
5
～
10mi
n,
弃上层液，留下胚胎组织碎块。
3)
向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入
1ml
消化液
,
轻轻吹吸
30sec
。
4)
加入等体积的培养液终止消化。室温下静止
5-10min
。
5)
弃上清
液
,
留下鼠胚组织块沉淀物。
6
）
加入
5ml
培养液重新悬浮鼠胚组织块
,
移入培养瓶内。每
5
个鼠胚的组织块可使用
1
个
100ml
的培养瓶。
7)
补加适量的培养液
,
使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。
37
℃
、
5%CO2
、饱和湿
度培养箱内培养。
8)
培
养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见组织块附着培养瓶表面
,
< br>周围生长出细胞。
补充培养液或更换培养液
,
继续培养。每天观察。
9)
< br>待细胞连成一片时
,
即可消化。消化时弃培养液
,
用
PBS
洗涤一次；
加适量消化液（以能
覆盖细胞层
为度
）
，在室温下作用大约
30sec
；弃
消化液，让残余消化液继续作用。轻敲培
养瓶底
,
当细胞层出现裂隙时，加入培养液终止消化。或在倒置显微镜下观察，当细胞与细
< br>胞之间分开即可终止消化。
10
）
补加
培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置
5
～
10min
。
11
）
上层
为单细胞悬液
,
下层为组织块沉淀。
将
上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内
,
弃组
< br>织块。
12
）以
800
～
1000rpm
5min
离心，弃上清。加入培养液
,
重新悬浮细胞沉淀。以
1:3
比例
传代
。采用
3
～
5
代细胞作为饲养细胞。
单细胞悬液培养法：
1)
～
5
）步骤同组织块培养法
1)
～
5)
步骤。
6)
重复组织块培养法
3
）～
4
）步骤
5
～
6
次
,
即重复消化鼠胚组织块
5
～
6
次。每次消化后都收
集上层液即单细胞悬液。最后一次消化后弃组织块。
< br>７
)
将收集到的单细胞悬液离心，
800
～
1000rpm
5min
。
８
)
弃上清
,
加入培养液
,
轻轻吹吸
,
制备成均匀的
单细胞悬液。
9)
移置培养瓶内。
5
个鼠胚制备出来的单细胞悬液可以使用
3
个
100ml
的培养瓶。
10)
补加适量的培养液，吹吸均匀。
37
℃
、
5%CO2
、饱和湿度培养箱内培养。每天观察。
11)
培养
2
～
3d
后
,
细胞连成片
,
即可消化。消化过程同组织块培养法９
)
步骤。
12)
以
1:2
～
1:3
比
例传代培养
,2
～
3d
传一代。采用
3
～
5
代细胞作为饲养细胞。
（
3
）培养结果
在培养
MEF
初始的
1
～
2
代时
,
杂细胞（非成纤维细胞的其他组织细胞）较多
,
细胞形态多样；
在第三代开始时
,
杂细
胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时
,
由于受
杂细胞
的影响
,
形态不够典型。
三）细胞冷冻
1.
当细胞
90%-100%
融合时
,
尤其细胞少量堆聚可冷冻。
2.
处理方法同传代培养
1-8
，每
25 cm2
的细胞
加
1ml FBS-
DMSO
重悬细胞。
3.
每个冷
冻管编号加
1ml
细胞悬液。
4.
置入
40C1
小时，放入
< br>1cm
厚的泡沫盒中置入
-800C
过夜，置入液氮长期保存。
四）灭活饲养层细胞并备饲养层皿
试剂和材料
HESC Medium
、
PBS(+)
、
PBS(-)
、
Mito
C
、
Trypsin-EDTA
离心管、移液管
Mito
C
处理（以
25
cm2
培养瓶为例）
1.
需要铺皿前一天，全换液。
.
2.
留
2ml
培养基。
3.
加
40ul Mito C
（
10ug/ml
）
。
4.
培养皿底以
0.1
％
Gelatin
溶液覆盖预处理。
5.
3
小时后，去培养基，处理方法同传代方法。
6.
重悬细胞，细胞计数，以、
7.0<
/p>
×
104/ cm2
（
< br>MEF
）铺皿。
7.
置于培养箱常规培养。
8.
15<
/p>
分钟后，取出皿，吹打皿中央，重新置于培养箱中培养。
五、复苏及冻存
hES
细胞
细胞被冻存在
10<
/p>
％二甲基亚砜
（
DMSO
）
中防止结晶的形成，
结晶的形成会损害细胞。
然而，
二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。<
/p>
步骤：
1
．从液氮中取出一管细胞；
2
．将冻存管置于
37
℃
水浴中
2
分钟（或放到管内溶液恰
好完全溶解）
；
3
．将细胞转移到一
15ml
Falcon
管中；
4
．加入
5ml
ES
培养基（用培养基冲洗冻存管）
；
5
．离心
200g
×
5min
；
6
．弃上清，用
2ml ES
培养基重悬细胞，吹打
10
次；
7
．接种在明胶包被（见下文）的
< br>6
孔或
6cm
组织培养皿；
8
．孵育。
冻存细胞
冻存液：
90
％
HS
< br>和
10
％二甲基亚砜
步骤：
1
．
1
×
PBS
洗
细胞并留少许
PBS
在培养皿内；
2
．用细胞刮刀收集细胞；
3
．将细胞转入
15ml
Falcon
管内并离心
200g
×
5min
；<
/p>
4
．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存
液中。
5
．分装于冻存管内，每管<
/p>
1ml
；将冻存管装入
Nalgen
冻存盒内。
6
．
置－
80
℃
过夜，第二天移入液氮。<
/p>
转载自丁香园
1
、
Stem Cell Analy
sis
干细胞分析（功能、表型、核酸含量、边群）
[Lond
on Research
Institute]
brief
introduction
：
Stem
Cell
Analysis
,FACS
Laboratory,
London
Research
Institute
干细胞分析，包括以下四方面内容：
Functional Analysis
Phenotyping
Nucleic Acid
content
Side Population analysis
2
、
Production of
ES Cell Chimeras by Aggregation wtih Eight-Cell
Stage Embryos
[Nagy
Lab
，
Mount Sinai Hospital]
brief
introduction
：
Production of
ES Cell Chimeras by Aggregation wtih Eight-Cell
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