蛋白质相互作用的研究方法

2021年2月28日发(作者：ake)

举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组

DN A

序列尚不能解答

许多生命问题。

基因 是相对静态的，

而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，

具有时 空性和

调节性，

是生物功能的主要体现者和执行者。

< p>
蛋白质的表达水平、

存在方式以及相互作用等

直接 与生物功能相关。

在所有生命活动 中，

蛋白质之间的相互作用是必不可少的，

它是细胞进行一切代 谢活动的基

础。细胞接受外源或是内源的信号，

通过其特有的信 号途径，

调节其基因的表达，

以保持其

生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，

它可以调控，

< br>介导细胞的许多生物

学活性。

虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，

但是大部分的蛋 白质都是和伴侣分子一起作

用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更 好地理解细胞的生物学活性，

必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，

这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。

在现代

分子生 物学中，

蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。

因此，< /p>

揭示蛋白质之间的相互

作用关系、建立相互作用关系的网络图，已 成为蛋白质组学研究中的热点。

一、生物物理学方法

1.

融合蛋白

pull- down

实验

融合蛋白

pull-down

技术基本 原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如

Sepharose

）

，当细

胞抽提液经过该基质时，

可与 该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，

而没有被吸附的

“杂< /p>

质”则随洗脱液流出。

被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用

pull-down

技

术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形 式表达，

即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体

蛋白相融合。

1988

年

Smith

等利用谷胱甘肽－

S

－转移酶（

glutathione-S-transferase

，

GST

）

融合标签从细菌中一步纯化出

GST

融合蛋白。从此

GST

融合蛋白 在蛋白质相互作用研究领

域里得到了极大的推广。

GST

融合蛋白在经过固定有

GST

（

glutathione

< p>
）的色谱柱时，就可以通过

GST

与

GSH

的相互

作用而被吸附。

当再有细胞抽提物过柱，

就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋

< p>
白。一般来说，

GST

融合蛋白

< br>pull-down

方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相

< p>
互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。

该方法比较简便，

避免了使用同位素 等危险物质，

在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。

类似的 融合蛋白很多，

如与葡萄球菌蛋白

A

融 合的

“诱饵”

蛋白可以通过固定有

Ig G

的色谱

柱进行纯化；

与寡聚组氨酸肽 段融合的

“诱饵”

蛋白可以通过结合

N i2+

的色谱柱进行纯化；

与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋 白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。

2.

亲和印迹

亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，

然后检测哪种

蛋白能与标记了的

“诱饵”

蛋白发生作用。

此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活

性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等 。

3.

免疫共沉淀

如果在非变性的条件下裂 解细胞，

蛋白质之间的相互作用还可以保持，

所以就可利用免疫 共

沉淀方法找出相互作用的蛋白质。这其中的例子包括

Harl ow

等。

利用抗体沉淀腺病毒的

EIA

蛋白时发现了真核细胞中有与

EIA

蛋白特异结合的蛋白质；

McMah on

等利用该方法确定了转录结构域相关蛋白质可以与

E2F1

和

c-Myc

转录因子相互作

用的蛋白质。

免疫 共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，

也可以找出未知的蛋白质< /p>

相互作用，

不管是两者的哪个，

其原则都 是一样的，

都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋

白质结合，之 后通过蛋白质

A

或蛋白质

G-

琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用

SDS- PAGE

鉴定。

< br>免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，

因为该方法可能出现假阳性的概率比较高 ，

设置的

对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白 的细胞系作为阴性对照等等。

4.

荧光共振能量转移技术

< p>
荧光共振能量转移技术的原理是：

处于激活状态的供体，

< br>可以将其本身的荧光传递到与之十

分邻近（通常在

10 nm

之内）的受体上。因此，如果用遗传突变的绿色荧光蛋白（

GFP

）或

是合成的荧光染料标记蛋白质，

< br>则可以通过荧光体之间的能量传递来确定两蛋白质的相互作

用。

< br>

这种方法较之上述的方法有两个优点：

（

1

）蛋白质之间的相互作用是发生在完整细胞里， 比较完整地反映了蛋白质在生理状态的

活动。

（

2

）利用这种方法，可以观察到蛋白质在细胞内的定 位。

二、分子生物学方法

1.

噬菌体展示技术

< br>噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。

其原理 是将蛋白

质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，

利用目的蛋白 质与特异配基的亲和力，

筛选和配基

特异结合的蛋白质。

噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，

这样就可以得到在文库中含量

很低的与配基特异作用的蛋白质。

2.

酵母双杂交

1989

年

Field

等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了 酵母的生长转录因子

GAL4

含有的两

个结构域，

DNA

结合域

（

DNA binding domain

，

BD

）

及转录激活域

（

DNA activating domain

，

AD

< br>）

，将已知基因（诱饵基因）和靶基因或含有靶基因的

c DNA

分别构建在含

BD

及

< p>
AD

质粒

载体上，当这两种质粒共同转化酵母感受 态细胞，若

BD

结合的诱饵蛋白能够与

AD

结合的

靶蛋白或文库中某些

cDN A

编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的

B D

与

AD

在空间上接近，呈现

GAL4

转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如

< br>His

及

LacZ

等基因的表达 ，从而在特定的缺陷培养基上生长。

因此，

利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，

还可以研究已知蛋白间的

相互作用。

利用酵母双杂交技术筛 选

cDNA

文库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白

间的相互作用，

一般首先考虑的问题是诱饵载体的构建。

< p>
编码诱饵蛋白的基因经酶切处理后，