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对于全世界许多研究者，
Novagen
的
pET
系统已成为在大肠杆菌中
蛋白表达的首选。
该系
统成功的一个主要原因是目标基因被克隆
到不为大肠杆菌
RNA
聚合酶识别的
T7
启动子之
下，因此在加入
T7
RNA
聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到
pET
载体的
基因实际上是
被关闭的，
不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。
重组质粒转移到染色
体上
含有一拷贝由
lacUV5
控制的
T7
RNA
聚合酶基因的表达宿主中，
并通过加入
IPTG
诱导表
达；也可通过
l
CE6
感染原始克隆宿主菌来提供
T7 RNA
聚合酶。使用大肠杆菌启动子系
统
(
如
tac
、
lac
、
trc
、
pL)
有困难的许多基因已经在
pET
系统中稳定克隆和表达。
T7
RNA
聚合酶的
选择
性和活性使得几
乎所有细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小
时目标产物就可超过细胞总蛋白的<
/p>
50%
。
新开发的
T7
驱动表达技术以
pETBlue
TM
系统为代表。
pETBlue
载体包括了
pET
用于表
达的优点，在目标基因克隆和质粒
DNA
操作的方面更为方便。
pETBlue TM
系统：新一代
T7
表达载体
pETBlue <
/p>
载体代表了新型表达载体，
它具备所有广受欢迎的克隆
载体的
最理想特点和
T7
驱
动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰的大肠杆菌
tet
启动子的反义方向插到
lacZ
a
-
肽编码区，
因此可进行蓝
/
白斑筛选。
正确定位于目标基因正义方向上游的
T7
转
录和翻译信号使表达成为可能。与标准
pET
载体一样，通过转化
λ
DE3
溶原菌并用
IPTG
诱导或通过
l CE6
感染原始宿主菌生产目标蛋白。
优点
·
蓝
/
白斑筛选，便于克隆
·
高拷贝数，质粒
DNA
高产
·
以
AccepTor TM
载体或
perfectly Blunt a
载体形式提供，便于快速
PCR
克隆
·
<
/p>
目标基因无基础水平表达，消除了毒性基因产物相关的质粒不稳定性
·
表达水平与经典
pET
载体相同
·
用
Tuner TM (DE3)pLacI
宿主菌实现真正的表达水平
“
变阻器
”
控制。
。
1
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PET
系统：大肠杆菌中蛋白表达的金字招牌
pET
载体中，
目标基因克隆到
T7
噬菌体强转录和翻译信号控制之下，
并通过在宿主细胞提
供
T7
RNA
聚合酶来诱导表达。
Novagen
的
pET
系统不断扩大，提供了用
于表达的新技术
和
选择
，
目前共包括
36
种载体类型、
15
种不同宿主菌和
设计用于有效检测和纯化目标蛋
白的许多其它相关产品。
优点
·
是原核蛋白表达引用最多的系统
·
在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低
·
真正的调节表达水平的
“
变阻器
”
控制
·
提供各种不同融合标签和表达系统配置
·
可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋
白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌
·
许多载体以
LIC
载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆
PCR
产物
·
许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化
阳性
pFORCE
TM
克隆系统具有高效克隆
PCR
产物
、
阳性
选择
重组体和高水平表达目标蛋
白
等特点。
pETBlue TM
系统
T7
驱动的严紧控制表达、蓝
/
白斑筛选、质粒产量高
新颖的
pETBlue TM
系统兼有广受欢迎的蓝
/
白斑筛选
载体所具有的通过目测确定重
组体和高质粒拷贝数，
以及
pET
载体严紧控制的高蛋白表达等特点。
蓝
/
白斑筛选通过使
用弱组成型大肠杆菌启动子
(
tet
)
驱动
lacZ
a -
肽表达而实现，而目标基因表达由相
反方向的
T7
启动子驱动。目标序列插入多克隆位点（
MCS
）破坏了
lacZ
a -
肽的表达，
在
NovaBlue
菌株中当存在
x-gal
时产生白
菌落表型，而带有非重组
载体的
菌落变蓝。由
< br>于
T7
驱动的蛋白表达要求插入片段克隆到相对于
tet
启动子的反义方向，因此实际上没
。
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有目标序列的基础表达。相对于
pET
载体，
pETBlue
质粒上高拷贝
PUC
复制起点增加
了
质粒产量，为测序、突变和其它质粒操作带来方便。
如果插入序列相对于
T7
lac
启动子为正义方向且符合每个
载体的
翻
译要求，
pETBlue
载体中目标基因可以高水平表达。用两种方法进行蛋白表达：用
l CE6
（
l pL
启动子控
制
T7 RNA
聚合酶表达的噬菌体）感染，或转化重组
pETBlue
质粒到宿主菌
Tuner TM
(DE3)pLacI
或
Origami
TM
(DE3)pLacI
中并用
IPTG
诱导。这些宿主菌
染色体上带有一拷
贝
lacUV5
控制的
T7
RNA
聚合酶基因，
并通过相容的
pLacI
质粒提供足够
lac
阻
遏蛋白，
以确保低水平的未诱导表达。
Tuner
菌株的
lacY
状态使整个培养细胞
被均一的诱导，并
随
IPTG
剂量诱导有不同的蛋白表达水平。
Origami
菌株能够增强胞质中二硫键形成。
pETBlue-1
pETBlue-1
便于从
5'
端编码开放读码框架的插入片段表达未融合的天然蛋白。该载体
EcoR
V
(GATATC)
克隆位点位于强
T7
基因
10
核糖体结合位点
（
RBS
）
附近。
含有
ATG
起
始密码子或
5'
端具有一个位置合适的
G
核苷酸插
入片段成为一个合适的大肠杆菌翻译起
始位点。
pETBlue-2
pETBlue-2
提供了载体编码的
ATG
起始密码子和多种下游克隆位点。
MCS 5'
和
3'
端两
套各三个重叠平末端酶切位点便于将任何插入片段克隆到读码框中。在载体确定的读码框
中，
这些酶产生的平末端终止于密码三联体的不同位置。
因此
只要插入方向正确，
任何插入
片段可克隆到经过合适平末端酶切
割的
载体的
读码框中。
而且，
任何不含内部终止密码子的
插入片段都可与
C-
末端
a
表位和
a
序列克隆到同一读码框中。
pETBlue TM PCR
克隆试剂盒
方便地将
PCR
扩增
DNA
直接克隆到
pETBlue
载体中
。
3
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除了含有未切割质粒的
pETBlue TM
系统，
Novagen
还提供可立即插入
PCR
产物的
pETBlue
载体。已有两种试剂盒：
AccepTor TM
载体试剂盒能够插入带单个
3' -dA
突出
的
DNA
，
如非校对
DNA
聚合酶
(
如
Taq
DNA
聚合酶
)
的扩增产物；
而
perfectly
Blunt
a
克隆试剂盒设计用于克隆任何末端形式的插入片段。
在
pETBlue-1 AccepTor
载体中表达插入基因的引物设计：
pETBlue-1
：用
5'
端
ATG
开始的正义引物进行扩增
，能够确保在大肠杆菌中有效合成蛋
白的
RBS
和翻译起始位点之间的最适距离。目标序列羧基端引物设计没有限制。
Met---
正义引物
5'
-ATG XXX ---
反义引物无限制
pET
系统概述
pET
系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统
。根据最初由
Studier
等开发
的
T7
启动子驱动系统，
Novagen
的
pET
系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平
pET
系统提供
6
种载体
-
宿主菌组合，
能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没
有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化
选择
是必
要的。
宿主菌株
质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有
T7
RNA
聚合酶基因的宿主菌（
λ
DE3
溶原菌）中表达目标蛋白。在
λ
DE3
溶原菌中，
T7 RNA
聚合酶基因由
lacUV5
启动<
/p>
子控制。
未诱导时便有一定程度转录，
因
此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的
一些基因。而宿主菌带有
pLysS
和
pLyE
时调控会更严紧。
pLys
质粒编码
T7
溶菌酶，
它是
T7 RNA
聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
pLysS
宿主菌产生低量
T7
溶菌酶，而
pLysE
宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的
λ
DE3
溶原菌。
。
4
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有
11
种不同
DE3
溶原化宿主菌。使用最广泛的为
BL21
< br>及其衍生菌株，它的优点在于缺
失
lon
和
ompT
蛋白酶。
B834
菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用
35 S-
甲硫氨酸和
硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。
BLR
为
recA
-
衍生菌株，改善了质粒单
体产量，有助于稳定含有重复序列的目
标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶
(
trxB
)
突变菌株
(AD494,BL21
trxB
)
，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。
Origami
TM
和
OrigamiB
菌株
为
trxB/gor
双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。
Origami
和
OrigamiB
宿主菌
的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。
新的
Rosetta
TM
菌株补充了四种大肠
杆菌稀有密码子的
tRNA
，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。
其它菌株背景包括
K-12
菌株
HMS174
和
NovaBlue
，象
BLR
一样为
recA
-
。这些菌株
可稳定表达其产物可能导致
DE3
噬菌体丢失的某些目标基因。
由于存在
F
附加体编码的高
亲和力
lacIq
阻遏蛋白，
NovaBlue
为一个有用的严紧型宿主菌。此外，
Novagen
提供了
λ
DE3
溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌
。表达高毒性基因或制备新的
λ
DE3
溶原菌的另一替代方法是通过
l
CE6
感染提供
T7
RNA
聚合酶。
虽然不如用
IPTG
诱
导
λ
DE3
溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。
高严紧性
T7
lac
启动子
除了在宿主菌水平
选择
三种基本的表达严紧性，
pET
系统中
T7
启动子本身提供了两种
不
同的严紧性
选择
：
< br>普通
T7
启动子和
T7
lac
启动子。
T7
lac
启动子在启动子区下游
17bp
处含有一个
25bp
的
lac
操纵序列。该位点结合
lac
阻遏蛋白能够有效降低
T7 RNA
聚合
酶的转录，这样提供了在
λ
DE3
溶原菌中抑制基础表达的第二种基于
lacI
的机制（除了
抑制
lacUV5
）。含
T7
lac
启动子的
pET
质粒还具有它们自己的
lacI
，确
保足够的阻遏
蛋白结合到操纵基因位点上。
< br>在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体
/
宿主菌组合。
控制诱导的表达水平
在许多情况下，
表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、
培养条件和
合适的载体
配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载
体
/
宿主菌
。
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