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荧光染料简介
荧光定义
荧光染料会发出荧光，
所谓荧光是指
物质分子吸收紫外光后发出的可见光荧光以及吸收
波长较短的可见光后发出的波长较长的
可见光荧光。
荧光发生机理
每个分子具有一系列严格的分立能
级，
室温下物质分子大部分处于
基态<
/p>
，
当这些物质
在
光的照射下吸收光能后，
进入新的状态，
称为
< br>
激发态
。
处于
激发态
的分子是不稳定的，
它可以通过以
10-9-10-7
秒的极短时间内发射光量子回到基态。这一过程称为荧光发射，
也就是发
光。
激发光谱和发射光谱
任何发荧光的物质分子都具有两个
特征光谱
--
激发光谱和荧光发射光谱。
在
测定时，
用以激发荧光的吸收光谱，
一般称为荧光物质的激发光
谱，
它是指相对于不
同激发波长的辐射所引起物质发射某一波长
荧光的光谱。
荧光发射光谱简称为发射光谱，是
指某一波长激发光引起物质发射不同波长荧光的光
谱。
荧光效率和荧光强度
分子能产生荧光必须具备两个重要
的条件，
一是物质的分子必须具有吸收一定频率光能
的基团
--
生色团，二是必须具有能产生一定光量子的荧光团。
而物质发射荧光的能力用荧光效率表示。荧光效率为荧光团发射荧光的光量子数与生
色团吸收的光量子数的比值称。
荧光效
率往往小于
1
。如罗丹明
B
的乙醇溶液的荧光效率为
0.97
；荧光素的水溶
液的
荧光强度为
0.65
，荧光效率与
物质结构有关，还与所处的环境紧密相关。而对于某种荧光
物质在特定的环境下它的荧光
效率是固定的。
在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。即荧光强度（发射
荧光的光量子数）等于吸
收光强度乘以荧光效率。
提高荧光强度的根本方法
选择适当强度的光源作为荧光物质
的激发光源，
和选择适合于被检荧光物质选择性吸收
的光谱滤光
片作为激发滤光片，
是提高荧光强度的根本方法。
许多染料的最
大吸收峰并不是
紫外光，而是在
400nm-500nm
的蓝绿光，所以紫外光不是这些染料的最佳激发光源，可
见光才是这些
染料的最佳光源。
常用荧光色素波长
名称
最大吸收波长（
nm
）
最大发射波长
（
nm
）
适用性
吖啶橙（
Acridine
orange
）
405
585
中
吖啶黄（
Acridine
yellow
）
455
620
好
碘化丙啶（
Propidium
iodide
）
488
620
中
溴化乙啶（
Ethidium
bromide
）
488
610
中
光神霉素（
Mithramycin
）
457
派若宁
Y
（
Pyronin Y
）
488
罗丹明
123
（
Rhodamine 123
）
560
赫斯特
3
3258
（
Hoechst
33258
）
338
荧光素
（
Fluorescein
）
495
荧光黄（
Lucifer
yellow
）
428
伊红（
Eosin
）
525
四甲基罗丹明（
Tetramethyl
rhodamine
）
555
SYBR Green
Ⅰ
498
SYBR Gold
495
SYPRO Orange
475
SYPRO Red
545
NBD
467
GelStar
495
黄色荧光蛋白
EYFP
515
绿色荧光蛋白
EGFP
490
蓝色荧光蛋白
EBFP
380
570
580
540-660
505
525
544
546
580
522
540
580
635
538
530
530
510
440
好
好
中
差
好
好
中
中
好
好
好
中
好
好
好
好
差
常用抗体标记荧光染料的特性及其应用
1
、
FITC
（
异硫氰酸荧光素）绿色
：激发波长
488nm
，最大发射波长
525nm
。
1
）其标记的抗体适用于所有配备
488nm
氩离子激光器的流式细胞仪；
2
）在流式细胞仪的
FL1
通道检
测；
3
）可用于荧光显微镜技术
4
）荧光强度易受
PH
值影响，
PH
值降低时其荧光强度减弱。
2
、
Alexa Fluor 4
88
：激发波长
488nm
，最大发射
波长
519nm
。
< br>1
）其标记的抗体适用于所有配备
488nm
氩离子激光器的流式细胞仪；
2
）在流式细胞仪的
FL1
通道检测；
< br>
3
）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜
技术；
4
）在较宽的
PH
值范围内保持稳定（
PH4
～
10
）。
3
、
Cy3
：激发波长
488nm
，最大发射波长
570nm
。
1
）其标记的抗体适用
于所有配备
488nm
氩离子激光器的流式细胞仪；
2
）在流式细胞仪的
F
L2
通道检测；
3
）适用于荧光显微镜技术；
4
）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低
于
PE
。
4
、
Cy5
：激发波长
< br>633/635nm
，最大发射波长
670nm
。
1
）其标记的抗体
适用于所有配备
633nm
氩离子激光器的流式细胞仪；
2
）在流式细胞仪的
FL4
通道检测；
3
）适用于荧光显微镜技术；
4
）
同样为小分子染料，
非常适合需小分子染料的流式细胞术，
荧光强度低于
APC
。
5
）与单
核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
PI
（碘化丙啶）：橙红色
620nm
5
、
PE
（藻
红蛋白）橙黄色
：激发波长
488nm
，最大发射波长
575nm
。
1
）其标记的抗体适用于所有配备
488nm
氩离子激光器的流式细胞仪；
2
）在流式细胞仪的
FL2
通道检测；
3
）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光
显微镜技术，但适用于激光共聚焦显
微镜技术。
6
、
PE-TR
：激发波长
488nm
，最大发射波长
615nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL3
通道检测；
2
）可适用于小功率激光器的流式细胞仪
，也可使用于大功率激光器的大流式细
胞仪。
7
、
PE-Alexa Fluor
610
：激发波长
488nm
，最大发
射波长
628nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL3
通道检测；
2
）荧光强度高；
< br>3
）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细<
/p>
胞仪。
8
、
PE-Alexa Fluor
647
：激发波长
488nm
，最大发
射波长
668nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL4
通道检测，
BD
细胞仪
FL3
通道检测；
2
）不易湮灭；
3)
可适用于小功率激光器的流式细胞仪，
也可使用于大功
率激光器的大流式细胞
仪。
9
、
PE-Cy5
：激发波长
488nm
，最大发射波长
670nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL4
通道检测，
BD
细胞仪
FL3
通道检测；
2)
可适用于大、小功率
的流式细胞仪；
3
）淬灭性强，不适
用于传统的荧光显微镜技术；
4)
可
与
FITC
、
PE
搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与
APC
搭配。
5
）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。
10
、
PE-Cy5.5
：激发波长
488nm
，最大发射波长
694nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL4
通道检测，
BD
细胞仪
FL3
通道检测；
2)
可适用于大、小功率
的流式细胞仪；
3
）淬灭性强，不适
用于传统的荧光显微镜技术；
4)
可
与
FITC
、
PE
、
APC
搭配，荧光干扰小、补偿小，是
< br>APC
比较理想的搭配。
11
、
PE-Alexa Fluor
700
：激发波长
488nm
，最大发
射波长
723nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL4
通道检测，
BD
细胞仪
FL3
通道检测；
2
）光淬灭性很强，要绝对避光。
12
、
PE-Cy7
< br>：激发波长
488nm
，最大发射波长
< br>767nm
。
1
）在
Beckman Coulte
r
流式细胞仪的
FL4
通道检测，
BD
细胞仪
FL3
通道检测；
2)
可适用于大、小功率的流式细胞仪；
3
）光淬灭性很强，要绝对避光；
<
/p>
4
）可与
FITC
、
PE
搭配，与
FITC
无光谱重叠，与
APC
搭配荧光干扰小，补偿小，
是比较理想的搭配。
13
、
TR
：激发波长
595
nm
，最大发射波长
615nm
。
1
）其标记的抗体适用于配备
Texas Red
激光器的流式细胞仪；
2
）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。
14
、
APC
（
别藻青蛋白）红色
：激发波长
633
/635nm
，最大发射波长
660nm
。
1
）其标记的抗体适用于所有配
备氦氖激光器的流式细胞仪；
2
）在
BD
细胞仪的
FL4
< br>通道检测，在
Beckman
Coulter
细胞仪只有配备双激光器
的
FC500
才能检测到。
630nm
波长的氦氖激光或红色
二极管激光激发
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