-
小鼠胚胎切片原位杂交
（一）主要试剂及配制方法：
a)
原位杂交用
10
×
PBS
储存液（
0.5
L
体积配方）
：
向
1L
烧杯中依次加入
29.22
g
NaCl
，
13.86 g Na
2
HPO
4
·
12H
2
O
和
1.763
g NaH
2
PO
4
< br>·
2H
2
O
，然后加入
400mL ddH
2
O
充分搅
拌溶解，
用固体
NaOH
将
pH
调节至
7.4
，
然后加入
ddH
2
O
定容至
0.5 L
，
最后各组分终浓度
为
NaCl=1.3mol/L
，
Na<
/p>
2
HPO
4
=7
0mmol/L
，
NaH
2
PO
4
=30mmol/L
，高压灭菌后室温保存备用；
b)
1
×
PBS
工
作液：将
10
×
PBS
储存液用灭菌水稀释
10
倍即可；
c)
10
×甘氨酸溶液：称取甘氨酸
10g
溶于
ddH
2
O
或
DEPC
水中，最后补足
ddH
2
O
定
容至
10
00ml
，高压灭菌备用。该液为储备液，
-20
℃
储存。使用时用
PBS
将
10
×甘氨酸储备
液稀释为工作液（<
/p>
1.0mg/mL)
；
d)
5M NaCl
：在
800ml
水中溶解
29
2.2g NaCl
，加水定容至
1L
，高压灭菌后室温保存
备用；
e)
1M Tris-HCl (
pH7.5
，
pH9.5)
：
在
800ml
水中溶解
121.91g Tris
碱
,
加入
浓
HCl
调节
pH
值至所需值（应使溶液冷至室温后方可最后调定
pH
值），
然后加水定容至
1L
，最后高
压灭菌，
室温保存备用；
f)
1M MgCl
2
< br>：在
800ml
水中溶解
203
.4g MgCl
2
·
6H
2
O
，用水定容至
1L<
/p>
，高压灭菌，
室温保存备用；
g)
20%
（
W/V)SDS
：
20 g
SDS
溶解于
80 mL ddH
2<
/p>
O
中，加热到
68
?
C
溶解，加热的同
时用玻璃棒搅
拌助溶，用浓盐酸调节
pH
值到
7.2
，加水至
100
mL
，高温高压灭菌，室温保
存备用；
h)
3%
过
氧化氢溶液：用于组织脱除血色，也可起到一定
RNase
抑制
剂效果，使用时
将
H
2
O
2
原液（
30%
）用
ddH
2
O
稀释
10
倍即可使用；
i)
2
μg/
mL Proteinase
K/PBS
：使用时配制，将
Proteinase K
(20mg/mL
，
-20
?
C
冷冻保
存）用
PB
S
稀释
10000
倍使用；
j)
乙酰化试剂：
如配制
40
mL
溶液，
需加入
530
?
L
三乙醇胺，
100
?
L
冰乙酸，
70
?
L
浓
HCl
，
ddH
2
< br>O
定容至
40
mL
；
k)
NT
Buffer
：各种成分终浓度为
0.1 M Tris-
HCl ( pH7.5 )
，
0.15 M
NaCl
。如配制
1
L
该溶液，需加入
100 mL 1M Tris-HCl (
pH 7.5 )
，
30 mL 5 M NaCl
，
ddH
2
O
定容至
1 L
；
l)
NTM
Buffer
：各种成分终浓
度为
0.1
M
Tris-HCl
(
pH9.5
)
，
0.1
M
NaCl
，
0.05
M
MgCl
2
。
如配制
40
mL
该溶液，
需加入
4 mL 1 M
Tris-HCl ( pH 9.5 )
，
0.8 mL 5
M NaCl
，
2 mL
1 M M
gCl
2
，
ddH2O
定容至
40 mL
；
m)
20×
SSC
：如配制
250
mL
该液体，需要加入
NaCl
43.8
g
，二水合柠檬酸钠
（
C
6
H
5
O
7
Na
3
·
2H
2
O
）
22.1
g
，然后加入
ddH
2<
/p>
O
至
200
m
L
，加入
HCl
或
NaOH
调节
pH
至
7.0
，最后定容至
250mL
，高压灭菌备用；
n)
50×
Denhardt's
：
10g
聚蔗糖（
Ficoll 400)
，
10g
聚乙烯吡咯烷酮（
PVP
）
，
10g
< br>牛血清
白蛋白（
BSA
）用水定
容至
1L
，过滤后
-20
?
C
保存备用；
o)
杂交液（预杂交液）
：即
5×
SSC Hybridization
Buffer
，各成分终浓度及用量如下表：
配方一
试剂
去离子甲酰胺
20×
SSC(pH7.0)
50×
Denhardt's
100mg/mL
酵母
tRNA
100mg/mL
鱼精
DNA
DEPC
水
Total
使用量
25mL
12.5mL
5mL
125
μ
L
250
μ
L
7.125mL
50mL
终浓度
50%
5×
5×
250
μg/mL
500
μg/mL
试剂
去离子甲酰胺
20×
SSC(pH7.0)
50×
Denhardt's
100mg/mL
酵母
tRNA
20%SDS
100mg/mL
肝素
DEPC
水
Total
配方二
使用量
25mL
12.5mL
5mL
125
μ
L
2.5mL
25
μ
L
4.85mL
50mL
终浓度
50%
5×
5×
250
μg/mL
1%
50
μg/mL
注：配制好的预杂交液在
-20
?
C
保存备用；
p)
马来酸缓冲液：含
100mM
马来酸（
Maleic
acid,
顺丁烯二酸）和
150mM NaCl
，
pH
为
7.5
；如配制
500mL
该缓冲液：向
400mL
去离子水中加入
4.38g
NaCl
和
5.81g
马来
酸，
然后加入适量固体
NaOH
调节<
/p>
pH
至
7.5
，
定容为
500mL
，灭菌后
-20
℃
保存备用；
q)
10×
封闭剂
（
Blocking Reagent)
：
向
80mL
马来酸缓冲液中
加入
10g
的脱脂奶粉粉末，
搅拌后定
容至
100mL
，该溶液很难溶，需加热，可以直接高压灭菌致
溶，然后
-20
℃
保存备
用；
（注：
10×
封闭剂也
可用
NT Buffer
来配制）
r)
抗体溶液：抗体原液用
1×
封闭剂稀释
5000
倍后使用，可回收存于
4
?
C
再使用；
s)
<
/p>
NBT
溶液：把
0.75g
氯化氮蓝四唑（
NBT
）溶解于
10mL70%
的二甲基甲酰胺中
,
保存于
4
℃
。
t)
BCIP
< br>溶液：把
0.5g
的
5-
溴
-4-
氯
-3-<
/p>
吲哚磷酸二钠盐（
BCIP
）溶解于
10mL
的二甲
基甲酰胺中，保存于
4
℃
u)
染色液：
8-
12μL NBT/BC
IP
混合溶液（
NBT
：
BCIP=1:1
）加到
1mL NTM
溶液中；
v)
10×
TE
：
Tris-HCl(pH7.5)
终浓度为
0.1M
，
EDTA
终浓度为
0.01M
，配制
< br>1L
该溶液
配方如下：
100m
L 1M Tris-HCl(pH7.5)
，加
20mL
0.5M EDTA
（
pH8.0)
，定容至
1L
，高压灭
菌室温保存备用
。
（二）主要实验步骤：
(1)
切片脱蜡
-
杂交（第一天）
a)
将切片按一下顺序进
行脱蜡并水饱和（室温下操作）
：
二甲苯
5
分钟（×
3
次）
通风橱操作
100%
乙醇
/PBS
5
分钟（×
2
次）
镜检是否组织完整
75%
乙醇
/PBS
5
分钟
50%
乙醇
/PBS
5
分钟
1×
PBS
5
分钟（×
2
次）
注意：
防止脱片，如果组织有脱落的
趋势，在每步操作中轻拿轻放，并且尽量水平放置
片子。
b)
蛋白酶
K
处理：
2
μg/
mL
Proteinase
K/PBS
，室温反应
5
分钟左右；在杂交盒中放
平操作，
可将
200~300
μL
蛋白酶
K
滴加于切片上形成液滴并刚好覆盖胚胎；
蛋白酶
K
的作
用是在胚胎切片上消化打孔；
c)
如果切片上在胚胎
的心脏附近有红色的血迹，
可用
H
2<
/p>
O
2
（终浓度为
3%
）
室温漂白
3~5
分钟；
d)
用甘氨酸
（终浓度为
2mg/mL
< br>）
处理
10
分钟，
以终止蛋白酶
K
的消化和
H
2
O
2
的漂<
/p>
白；应先配制
20mg/mL
的甘氨酸保
存于
4°
C
冰箱，使用时用
PBS
稀释
10
倍；
e)
切片用<
/p>
PBS
漂洗
5
分
钟
×
两次后，用三乙醇胺乙酰化处理
1
5
分钟；
0.1M
三乙醇胺
的配方是：
530
μL
三乙醇胺，
70
μL
37%
HCl
，
100
μL
冰醋酸，灭菌水补齐至
40mL
；
f)
PBS
< br>漂洗，室温，
5
分钟（×
3
次）
；
g)
预杂交：将切片平放至密封小盒
内，
滴加预杂交液，使胚胎被完全覆盖；室温静置
5
分钟后，
65
?
C
放置
1
小时。可在盒底铺一层滤纸后加一些
5
×
SSC
，
以保持湿润；注意保
持切片水平，防止杂交液侧流；
h)
杂交：
去掉预杂交液，
加上含有
300~500 ng/mL
的探针的杂交液，
盖上一层石蜡膜，
并注意排出
气泡；将小盒密封好，放入
65
?
C<
/p>
恒温箱内，静置过夜；
(2)
抗体反应（第二天）
a)
揭掉切片上的石蜡膜，
注意揭膜的时候要用镊子提一个角，
后卷变压边揭。
如果切
片上液体已蒸发，可将切片放置
5
< br>×
SSC
中浸泡片刻再揭膜，泡下来也勉强可以；
b)
洗净：
0.2
×
SSC
65
?
C
1~2
小时洗净；
（用含
0.1%SDS
的
0.2
×
SSC
洗效果更好）
0.2
×
SSC
室温
10
分钟；
NT Buffer
室温
5
分钟；
c)
封闭：
将切片放入小盒内，加上
1
×封闭剂，
室温反应
1
小时；
d)
抗体反应：
去掉封闭剂，加上用
1
×封闭剂稀释的抗体溶液，
4
?
C
静置过夜（推荐）或者
37
?
C
反
应
4
小时；
(3)
染色（第三天）
a)
取出切片，洗净；
b)
NT Buffer
，室温，
5
分钟（×
3<
/p>
次）
；