-
抑制端粒保护蛋白
TPP1
表达诱导
ATM
依赖
DNA
损
伤反应
端粒保护蛋白
TPP1shRNA
逆转录病毒表达载体
shTPP101
，
shTPP102
，
与表达外源性
TPP1
的
TP
P1
睭
A
质粒共同转染
293T
细胞，
WesternBlot
检测
shTPP1
抑制外源性
TPP1
蛋白表达；
RT
睵
CR
检测
shTPP1
抑制小鼠胚胎成纤维细胞（
mouseembryonicfibroblast,ME
F
）
内源性
TPP1mRNA
的表达
.
再用
shTP
P1
分别感染
ATM
＋
/
＋
MEF
和
ATM
－
/
－
MEF
细胞后，分别采用细胞生长曲线和
BrdU
掺入法检测细胞增殖，
免疫荧光
/
端粒肽核酸荧光原位杂交法（
IF/PNA
睩<
/p>
ISH
）检测端粒功能
障碍诱导损伤灶（
TIF
）的形成
.
结果：
shTPP101
和
shT
PP102
均能明显
抑制外源性
TPP
1
蛋白和内源性
TPP1mRNA
的表
达，
shTPP101
和
shTPP1
02
作用于原代培养的
MEFs
后细胞
生长缓慢，
BrdU
阳性细胞数
量分别
占
8.0%
和
8.7%
，显著低于对照细胞的
29.3%(P<0.01,P<0.01)
；
而细胞表现为体积变大，形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变；
IF/PNA
睩
ISH
法检测结果显示，
shTPP1
作用于
ATM
＋
/
＋
MEF
细胞后导
致端粒
DNA
损伤标志物
-
磷酸化的
H2AX
（
γ
睭
2AX
）和
53BP1
损伤灶
（
TIF
）的形成，定量结果显示约
50%
的
ATM+/+
细胞中出现至少
5
个
TIF
；而在
shTPP1
作用后的
< br>ATM-/-
细胞中，端粒
γ
睭
2AX
和
53BP1
< br>形
成的
TIF
数量显著减少，出
现
5
个
TIF
的细胞数量不足
5%
，与对照组
细胞相
比无显著性差异
.
结论：抑制
TPP1
表达后诱发端粒
ATM
依赖的
DNA
损伤反应，进而抑制细胞增殖，促动细胞衰老
.
【关键词】端粒
;
短发夹
RNA;DNA;
损伤反应
0
引言
关键调控因子［
1
］
.
对肿瘤的研究发现，
绝绝大多数肿瘤细胞在分裂
增殖过程中保持稳定的端粒长度，因而通过干涉端粒的结构和
功能有
可能控制肿瘤发展［
2
］
.
当前发现端粒保护蛋白主要有
6
个亚单位：
TRF1
，
T
RF2
，
TIN2
，
< br>Rap1
，
POT1
和
TPP1
，他们共同组成端粒保护蛋白
复合体（
Shelterin
）［
3
］，其中
TPP1
是形成蛋白复合体的关键因子<
/p>
之一［
4-5
］
.
我们通过采用靶向端粒结合蛋白
TPP1
小片段干扰
RNA
（
siRNA<
/p>
）技术，构建
TPP1
短发夹
RNA
（
shRNA
）逆
转录病毒介导的表
达载体，观察抑制
TPP1
< br>表达后所诱导的端粒
DNA
损伤反应以及对细胞
增殖和衰老的影响
.
1.1
材料构建
TPP1
的
shRNA
寡核苷酸和
PCR
引物由美国
Sigma
公司合
成；
RNA
提取试剂盒、
RT
睵
CR
反应试剂盒、转染试剂
lipofectamine
（
Invitrogen
公司）；限制性内切酶
BglⅡ,EcoRⅠ,HindⅢ（
Biolabs
公司）；
γ
睭
2AX
鼠
mAb
（美国
Upstate
公司）；凝胶成像系统（美
国
AlphaInnotech
公司）；<
/p>
PCR
扩增仪
PTC200Engine
Cycler
（美国
MJResearch
公司）；
BX41
型显微镜（日本
Olympus
公司）
.
的正义链和反义链经变性和退火反应后形成双链
DNA
，用限制性内切酶
BglⅡ和
HindⅢ将其定向克隆至逆
转录病毒载体
Retro
瞤
Super
（含有
嘌呤霉素抗性筛选标记），经
E
coRⅠ和
HindⅢ酶切鉴定得到的阳性克
隆
Retro
瞤
Super
瞫<
/p>
hTPP1
，简称
shTPP1.
表
1shTPP101
和
shTPP102
的碱基序列
1.2.2
细胞培养和转染将质粒
shTPP101
和
shTPP102
分别转染病毒包
装细胞
293T
，转染操作按
lipofectaminePlus
说明实行：①接种
1×
105
个
293T
细胞于
10cm
细胞培养盘中，37℃，
50mL/LCO
2
培养过
夜；②更换为无血清
DMEM
，逐滴加入转染试剂
Lipofectamine
（含
4
μ
gshTPP1<
/p>
质粒
DNA
），培养
4
～
6h
后，更换为完全
DMEM
培养基培养；
③分别于培养
24
，
48h
后收集
293T
细胞培养上清感染
MEF
细胞，
72h
后加入
2
mg/L
嘌呤霉素实行筛选
.
1.2.3WesternBlot
检测
shTPP1
抑制外源性
TPP1
表达细胞转染
72h
后
收集
293T
细胞，超声破碎细胞后，4℃,10000g
离心
20min
，收集上清
实行蛋
白质定量测定
.
取
50
μ
g
蛋白质经
SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
后电转移至
PVDF<
/p>
膜，以抗睭
A
抗体检测
< br>TPP1
睭
A
的表达水平
.
1.2.4RT
睵
CR
检测
shTPP1
抑制
MEF
内源性
TPP
1mRNA
的表达收集含有
逆转录病毒的
293T
细胞培养上清，以
MOI=500
< br>的病毒滴度感染
MEF
细
胞，<
/p>
48h
后重复感染
1
次，
72h
后收集细胞提取总
RN
A
，采用
RT
睵
CR
检测
shTPP101
和
shTPP102
对
MEF
< br>细胞内源性
TPP1
在转录水平表达的
< br>干扰作用
.TPP1
上游引物序列：5′ATGTCCG
ATTCAGGGTTGCTGG3′，下游
引物序列：5′TCATACCTGGGT
TAACTCAGACTCTG3′.同时扩增
GADPH
作为
内参
.GADPH
上游引物序列：5′
TCACCACCATGGAGAAGGC3′,下游引物序
列：5′GCTAAGCA
GTTGGTGGTGCA3′.PCR
反应条件：94℃5min，94℃30s，<
/p>
55℃30s，72℃30s，共
25
个
循环
.
1.2.5
细胞生长曲线和
BrdU
掺入实验
< br>MEF
细胞经含有
shTPP101
和
shTPP102
表达质粒的逆转录病毒感染后，加入<
/p>
2mg/L
嘌呤霉素筛选
2wk
获得稳定表达
shTPP101
或
shTPP102
的细胞
.
然后按
5×104/孔接
种于细胞培养
6
孔板中，分别于第
0
，
2
，
4
，
< br>6
，
8
日作细胞计数，绘
制细胞数量
-
时间的生长曲线
.
同时按
2×104/孔的细胞接种
< br>8
孔的
chamberslide
，培养过夜后加入
BrdU
（终浓度为
10
μ
mol/L
），继续
培养
1h
，固定细胞后以抗
BrdU
抗体检测掺入
BrdU
后
的细胞及其数量
.
1.2.6
免疫荧光
/
端粒肽核酸荧光原位杂交法（<
/p>
IF/PNA
睩
ISH
< br>）检测端
粒功能障碍诱导的损伤灶（
TIF
）将逆转录病毒介导的
shTPP1
分别感
染
ATM+/+MEF
和
ATM-/-MEF
细胞，
2mg/L
嘌呤霉素筛选
2wk.
按
2×104
/
孔接种
chamberslide
培
养过夜，按文献［
6
］行
IF/PNA
睩
ISH
法检测
端粒上磷酸化的
H2AX
和
53BP
1
的
TIF
形成
.
同时
WesternBlot
检测
细
胞中磷酸化的
H2AX
（
γ
睭
2AX
）水平
.
统计学处理：
实验结果中两组计量资料之间的比较，采用
x±s
实行
t
检验
.
2
结果
2.1
逆转录病毒介导的
shTPP1
质粒的鉴定和功能检测按上述描述的方
法构建逆转录病毒介导的
shTPP1
质粒
.shTPP1
质粒
经限制性内切酶
EcoRⅠ和
HindⅢ酶切后，琼脂糖凝胶电
泳结果显示约为
300bp
的片段，
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