-
大规模测序
测序（
RNA
Sequencing
）—高速序列比对
2.
转录组测序（
Transcriptome
sequencing
）
3.
宏基因组测序
< br>1.
转录组
是指某个物种的特定组织或细胞在某一生理功
能状态下
所
有转录的
mRNA
产物
的集合，是基因组遗传信息传递和表达的重要步
骤和过程。
高通量转录组测序
可
以获得大量
转录本序列信息
，
定量基因
转录表达
水平
，
获得基因组转录区域及
其位点信息等，
在基因组序列拼接注释、
样
品间基因转录差异表达
（
差异表达分析为考点
）
及其功能研究等方
面有重要作用。
1.
有参考基因组的转录组分析技术路线
推荐平台：
Illumina HiSeq
2000
、
Illumina MiSeq
2.
无参考基因组的转录组分析
推荐平台：
Roche 454
FLX+
二、生物信息学分析
1)
有参考基因组的转录组
1.
原始数据整理、
过滤及质量评估
2.
转录组测序分析
?
与参考基因组比对
?
蛋白编码基因的
表达量分析
?
蛋白编码基因的
表达量差异分析
?
差异表达的蛋白编码基因的
聚类分析
（热图）
?
差异表达基因
富集分析
（
GO
、
KEGG
）
?
SNPs
的分析
（
SNPs
鉴定、
同义
/
非同义突变、
与已有
SNPs
数据库
比对）
?
可变剪切分析
?
UTR
区域鉴定
?
新基因
/
新转录本分析
3.
根据客户需求进行个性化分析
2)
无参考基因组的转录组
1.
原始数据整理、过滤及质量评估
2.
转录组测序分析：
?
序列拼装及拼装统计
?
Unigene
功能注释
?
Unigene
的功能
聚类分析
（
KOG
、
GO
）
?
Unigene
的
代谢途径分析
（
KEGG
pathway
）
?
Unigene
的
表达量分析
?
Unigene
的
表达量差异分析
?
差异表达的
Unigene
的
聚类分析
（热图）
?
差异表
达的
Unigene
的
富集分析
（
KOG
、
GO
、
KEGG
）
?
SNPs
的鉴定
3.
根据客户需求进行个性化分析
四、经典案例
案例
< br>1
：人前列腺癌融合基因鉴定
背景：
人前列腺癌发病率位于男性恶性肿瘤的首位，
并且发病率
近年
呈上升趋势。
目的：
对人前列腺癌及癌旁组织基因转录组进行检测分析。
了解人前
列腺癌的种族特异性及其可能的分子生物学机制。
结果：
人前列腺癌的融合基因具有种群特异性，
在欧美人群中普
遍高
频表达
（
50-80%
）
的融合基因
TMPRSS2-ERG
在中国人群中的表达率仅
有
20%
左右，而在欧美人群中尚未发现的融合基因
CTAGE5-KHDRBS3
和
USP9Y-TTTY15
在中国人群中
却有很高的表达频率，分别为
37%
和
35.2%
。
案例
< br>2
：玉米不同发育阶段转录组研究
背景：在单子叶植物中，分生组织分化产生叶片和叶鞘。玉米叶片发
育的整个顺序都
是沿着长度分布的，
不同的部位也呈现出不同的发育
阶段。
目的：对玉米叶片转录组进行分析，了解基因结构和表达差异。
结果：定位了超过
120 Mb
条序列
，定量叶片各发育阶段中成熟维管
束鞘和叶肉细胞中的转录本丰度，
发现在发育各个阶段的维管束鞘和
叶肉细胞中分别有
64%
和
21%
的基因差异表达。同时发现一
个动态转
录组，
其中叶基部初级细胞壁和基本细胞代谢的转录本
向顶端次级细
胞壁生物合成和
C4
光合
作用的转录本转变。
案例
3
：
西葫芦（基因组未知）转录组研究
背
景：西葫芦属于葫芦科，
富含维生素等营养成分，是一种重要的蔬
菜。然而与其相关的研究报道较少，限制了分子育种的发展。
目的：采用
Roche
454
FLX
对西葫芦的根、叶、花等组织进行转录组
测序，分析
SSR
和
SNPs
位点。
结果：通过从头组装获得平均长度为
626
bp
的
unigene 49,610
条。
发现超过
60%
的
unigene
被注释分类到一个或者多个
GO
分类信息中。
在检出的
SSR
中共有
1,882
种基序类型和
9,043
个
SNPs
位点。大量<
/p>
的分子标记，
为遗传性状和数量性状位点分析发挥了重要的作用。
五、
常见问题解答
1. Q
：
转录组测序
与基因表达芯片相比有哪些优势？
A
：与基因表达芯片相比，转录组测序具
有如下优势：首先，应用范
围广。
转录组测序无需预先设计探针
或了解物种的基因组信息，
同样
适用于基因组序列未知物种；第
二，准确性高。基因芯片原理是基于
核酸单链间的互补杂交，
当
杂交条件不同时，
或者丢失低拷贝转录本
信息，或者假阳性率高
。而转录组测序是基于对转录本序列的测定，
准确性很高，
而且
当测序深度足够时，
能够检测到极低低丰度表达的
转录本信息。
第三，信息丰富。转录组测序除了可以用于基因组注释
和基因转录表达分析，而且能发现
新基因，检测可变剪切，
SNPs
，融
合基因等。因此，
转录组测序在诸多方面优于基因表达芯片，已经成
为基因注释、表达检测和发现新基因等方面的主流技术。
2.
Q
：如何进行原核生物转录组分析？
A
：
针对原核生物的
mRNA
没有
poly
A
尾巴
的情况，
需要提供去除
rRNA
后经过
纯化的原核生物
mRNA
或
cDNA<
/p>
样品。
3.
Q
：转录组测序需要多少测序量？
A
：转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。
而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。
因此在测序之前，
需要对转录组的大小进行评估。
①针对有参考基因
组的物种，
可通过分析基因组信息，
统计编码基因个
数及其碱基数来
评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文
章；②针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。
4.
Q
：转录组测序和数字表达谱测序有什么区别？
A
：转录组测序和数字表达谱测序相比，主要有如下不同：第一，测
序目标不同。转录组测序可以测定特定组织中全部
mRNA
，而表达谱
测序只是测定
mRNA
< br>的酶切标签序列（
21 bp
）
；第二，代表性不同。
数字表达谱测序只测定
21bp
序列，而转录组测序测定转录本全长，
因而可以更准确地代表样品转录表
达情况；第三，应用范围不同。转
录组测序应用范围广泛，
不仅
可以检测表达量差异，
而且可以发现新
的转录本和可变剪切等。
而表达谱测序只能粗略检测表达量差异，
不
能反映基因转录表达的特点和规律；第四，参考序列要求不同。转录
组测序不仅可以
适用于基因组序列已知的物种，
而且也适用于基因组
序列未知的
物种。
而表达谱测序只适用于基因组序列已知的物种。
因
此，对于想要检测表达量差异的客户，我们推荐进行转录组测序，以
获
知更精确的转录组信息。
3.
宏基因
组测序（
Metagenome
sequencing
）
宏基因组学
（
Metagenomics
）也称为元基因组学，是以样品中
的微生
物群落作为整体进行研究的学科。自然界中约有
99%<
/p>
的微生物是不能
在实验室条件下进行纯化培养的。
宏基因组学研究不要求对每个微生
物进行分离纯化培养，
而是直接从样品中提取基因组
DNA
后进行测序
分析。通过宏基因组测序，能够解释微生物群落多样性、种群结构、
进化关系
、
功能活性及环境之间的相互协作关系，
极大地扩展了微生
物学研究范围。
目前宏基因组测序可以分
为环境微生物多样性检测和宏基因组
de
novo
测序。其中环境微生物多样性检测是指通过对环境中微生物
16S
rDNA
高变区
/ITS
的
PCR
扩增产物进行高通量测序，分析该环境下
微
生物群落的多样性和分布规律。宏基因组
de
novo
测序是指对环境样
品中所有微生物基因组<
/p>
DNA
片段化后进行高通量测序，
然后进
行序列
组装和基因注释，
获得部分不可纯培养微生物的基因组序
列，
分析该
环境下所有微生物基因集信息。
环
境
微
生
物
多
样
性<
/p>
检
测
（
Envi
ronmental
microbial
diversity
detection
）
一、
技术路线
推荐平台：
Roche 454
FLX+
、
Illumina MiSeq
二、生物信息分析
1.
原始数据整理、过滤及质量评估
2.
OTU
列表生成及注释
3.
基于物种丰度分析：
?
稀释曲线
?
Alpha
多样性分析
?
物种丰度差异分析
?
聚类分析（热图）
?
多元统计分析（根据实验设计）
4.
基于群落结构分析：
?
单样品物种分布
?
多样品物种分布
?
含进化关系的物种分布
?
Beta
多样性分析（
PCoA
、
NMDS
）<
/p>
5.
根据客户需求进行个性化分析
案例<
/p>
1
：人类“肠型”研究
背景：
人体肠道微生物与人类健康息息相关，
是否能以
这些微生物的
多样性来划分不同的肠型是一个值得探讨的问题。
目的：利用
Illumina
和
Roche 454
测序平台对不同年龄、体重、性
< br>别及国籍的人群肠道微生物多样性进行研究。
结果：<
/p>
研究发现人体胃肠道微生物区系并不是随机组合而成的，
在所
有受检人群中大致可以分为三种类型（
enterotypes
）
：拟杆菌型
（
B
acteroides
）
、
普
氏
菌
型
（
Prevotella
）
、
瘤
胃
球
菌
型<
/p>
（
Ruminococcus
）
。
对更大规模的人群
（
154
名美国人和
85
名丹麦人）
进行调查也得到了同样的结论，
这说明在人体的肠道内真正存活较好
的微生物生态组，
其数量可能并不太多。
不过这种分型方法和人体的
年龄、体重、性别或国籍都没有任何关联。
案例
2
：北极多年海冰和表
层海水微生物多样性研究
背景：北极多年海冰（
multiyear
< br>ice
，
MYI
）的急剧减少表
明这种环
境可能在
100
年后就会消失
，为了了解这种微生物多样性丧失的影
响，对北极附近的两处多年海冰的微生物群落进行
研究。
目的：利用
Roche
454
FLX
测序平台对
2
个多年海冰和
3
个海水
样本
中的微生物
16S
rDNA
的
V3
区进行测序，揭示出北极多年海冰和
表层
海水的微生物群落结构。
结果：
北极多年海冰与周围的海水中微生物存在很大的差异。其中，
多年海冰中的微生物群落多
样性与海水相当，但是丰度较少。此外，
还首次在北极海冰中发现蓝藻以及一些过去未曾
报道的低丰度微生
物物种。
五、常见问题解答
1.
Q
：哪些环境样品可以进行微生物多样性检测？
A
：针对宿主相关样品如皮肤、口腔、呼吸道、消化道、生殖道等进
行研究；针对环境相关样品，如土壤、水体、空气、盐湖、沼泽等进
行研
究。
2.
Q
：基于高通量测序的环境微生物多样性检测技术有何优势？
A
：
常规的宏基因组学研究方法
包括基因克隆文库、
变性梯度凝胶
电泳
DGGE/TGGE
等，
但这些方法的通病是信息量太小，
不能充分反映
复杂的环境微生物多样性和分布。
基因克隆文库构建和检测的工作量大，且自然界中
99%
的微生物在实
验室都没有办法纯化培养，
从培养基上挑取克隆菌株，
摇菌转化测序，
效率低下。
DGGE
法曾经广泛应用于检测微生物群落结构的多态性，
但是需要标准菌株，
且受到凝胶电泳特性的局限，
无法检测到稀有菌
群的种类，因此其重复性和分辨率都不甚理想。
第二代高通量测序无需构建质粒克隆文库，
这避免了文库构
建过程中
利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差，
可以直
接对环境样品
中的基因组片段进行测序，简化了基本操作，提高了测序效率，它能
够对一个群落中微生物的多样性作更加深入和全面的描述，
且具有通<
/p>
量高，重复性好，
精确度高的优点，因而在微生物生态学研究中逐
渐
占据了优势。
3.
Q
：人体为什么又叫“超级生物体”？
A
：
1958
年的诺贝尔生理及医学
奖得主
Joshua
Lederberg
提出了
“超
级生物体”
（
Superorganism
）
”的概念，是指
人体由真核细胞与体内
共生的微生物共同组成。研究发现正常人体肠道中存在约
1000-1500
种微生物，
重量达到
1-1.5
kg
。
微生物数量是人体细胞总数的
10
倍，
微生物基因数量是人类基因数量的
100
多倍。
宏基因组
de
novo
测序
（
Metagenome
de novo sequencing
）
一、
技术路线
推荐平台：
Roche 454
FLX+
、
Illumina HiSeq 2000
二、生物信息分析
1.
原始数据整理、过滤及质量评估
2.
基因集分析
?
基因功能注释
?
基因功能丰度差异分析
?
丰度差异的基因
GO
富集分析
?
丰度差异的基因
KEGG
富集分析
?
聚类分析（热图）
?
多元统计分析（根据实验设计）
3.
基于物种丰度分析：
?
稀释曲线
?
Alpha
多样性分析
?
物种丰度差异分析
?
聚类分析（热图）
?
多元统计分析（根据实验设计）
4.
基于群落结构分析：
?
单样品物种分布
?
多样品物种分布
5.
微生物基因组序列组装和拼接
6.
根据客户需求进行个性化分析
三、样品要求
1.
样品采集：采集条件的一致是最为重要的环节，需严格按照标准
采样，采样后立
即冷冻保存。
2.
样品
DNA
：环境因素异常复杂，许多物质或抑制因子会影响后续
PCR
、测序文库构建和序列测定，常规提取方法不一定适合，建议按
公司要求采用专用试剂盒提取。基因组
DNA
浓度＞
100
ng/
μ
l
，总量
＞
20
μ
g
，
OD
260/280
在
1.8-2.0
之间，并确保电泳检测无明显
RNA
条带，
基因组条带清晰、完整；基因组
DNA
完全无降解；提供
DNA
电
泳检测照片，用自封袋密封后随样品
一起送样。
3.
样品保存期间切忌反复冻融。
4.
送样管务必标清样品编号，管口使用
Parafilm
膜密封。
四、经典案例
案例
< br>1
：牛瘤胃中纤维素降解微生物
de
novo
测序
背景：
纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物资源。
牛在反刍过程中
< br>涉及到纤维素的分解，
研究牛的消化机制，
将为寻找可用
于生产生物
燃料的酶奠定基础。
目的：研究人员将柳枝稷样品置于牛的瘤胃中培养
72 h
，采用
Illumina
平台对附着在样品
上的所有微生物进行基因组分析。
结果：测序分析得到
268
Gb
的宏基因组数据，确定了超过
27,775
个
碳水化合物相关的酶基因和
15
个高
丰度不可培养的微生物基因组。
将部分基因导入细菌，然后由这些细菌产生了
90
种蛋白质酶。这一
数据集极大地丰富了纤维素
相关降解微生物基因组及降解基因集。
五、常见问题解答
1. Q
：针对
16S
rDNA
测序和宏基因组
de
novo
测序有什么不同？
A
：
16S rDNA
测序是针对细菌核糖体小亚基的特定高变区进行
PCR
扩
增，反映物种。
测序仪
简介
Read
数据量
< br>耗
时
错误
长度
/run
/run
第
一
带
Sange
Sanger
1000bp
56kb
测序
r/AB
双脱氧
3730D
终止法
NA
Analy
zerr
二
代
测
Solex
边合成
2*75bp
20.5-2
9.5d
替换
序
<
/p>
a/Ill
边
测
5Gb
umina
序，
Genom
e
Analy
zer
454/G
焦磷酸
400bp
400-60
10h
插入，
S FLX
测序
0Mb
缺失
Titan
ium
Serie
s
三
代
测
Helis
边合成
30-35b
21-28G
8d
插入
序
cope/
边测序
p
b
Helic
os
Genet
ic
Analy
sis
Syste
m
技术
原理
替换率
插
入
率
1.5%
0.003
%
0.004%
0.5%
0.2%
4.5%
对于测序仪的评价指标
1
、
读长：长读长在序列拼接、定位、跨越重复区域的应用中有着极
大优势。如在
De novo assembly
（无参考序列基因组）时，困难在
于如何跨越高
/
低
GC
含量而完成整个基因组的拼接。
NGS
的读长都很短（通常为
< br>100-150bp
）
，拼接完整的难度很大，长读
长还可以帮助变异检测的准确定位。
2
、耗时
3
、准确率
第一代测序
：
1
、
Sanger
双脱氧核苷酸末端终止测序法
原理：由于
ddNTP
的
2
?和
3
?都不含羟基，在
DNA
合成反应中
不能形
成磷酸二酯键，因此可以被用来中断
DNA
合成反应
。在
4
个
DN
A
合成反
应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的
某种
ddNTP
，
通过凝胶电泳和放射
自显影后，
可以根据电泳带的位置确定待测分子
的
DNA
序列。
（放射性标记，
对人体有害，后来发明以荧光标记代替放
射性同位素标记、
以
荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射
性自显影的自动测序仪）
2
、
Gilbert
化学讲解法
原理：用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列
毛细管电泳技术
一次可以测
48-384
个独立样品，一天
1-8Mb
的碱基信息。
第一代测序：工作量大，耗
时多，花费更多，
但读取长度大
。
第二代测序（高通量测序）
(NGS)
一、
Illumina
测序仪
原理：
1.
文库制备
将基因组
< br>DNA
打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末
端加上
接头
(adapter)
。
2.
产生
DNA
簇（
DNA
簇和可逆终止子为其
核心专利技术）
利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物
，
DNA
片段变成单链后
通过与芯片表
面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。
另外一端
（5’或
3’）随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，
形成
“桥
(bridge)
“。反复<
/p>
30
轮扩增，每个单分子得到了
1000
倍
扩增，成为单克隆
DNA
簇
。
DNA
簇产生之后，
扩增子被线性化，测序
引物随后杂交在目标区域一侧的通用序列上。由独立软件自动生成
DNA
簇在
5
小时内完成（手动
30min
）
3.
测序
边合成边测序（
Sequencing By Synthes
is
）
，加入改造过的
DNA
聚
合酶和带有
4
种荧光
标记的
dNTP
。
< br>这些核苷酸是“
可逆终止子
”，
因为
3’羟基末端带有可化学切割的部分，它只容许
每个循环掺
入单
个碱基
。此时，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列
第一轮反
应所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复
3'
端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此继续下去，直到每条模板序列
都完全被聚合为双链。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可
以
得知每个模板
DNA
片段的序列。
目前
的配对末端读长可达到
2×50
bp
，更长的读长也能实现，但错误率会增高
。读长会受到多个引起信
号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。
4.
数据分析
：
自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次
分析。
5
、优点：
（
1
）可扩展的高通量，目前每次运行
后可获得
超过
20 GB
的高品质
过滤数据，流动池支架，使每轮运行所得的高质量数据增加
20%<
/p>
；
（
2
）
需要样品量少，
系统需要的样品量低至
100ng
，能应用在很多
样品有限的实验
（比如免疫沉淀、显微切割等）中。
（
3
）运行成本比其他测序仪可能更低。
（
4
）简单快速自动化，制备样本文库可以在几个小时内完
成，一个
星期就可以得到高质量的数据，
支持超过
100
个测序循环，
易用且自
动
（
5
）
新颖的测序化学技术
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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