-
微生物学通报
MAR 20
,
2008
,
35(2)
:
1~6
p>
Microbiology
Copyright?2008 by Institute
of Microbiology, CAS
tongbao@
专论与综述
猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
韦祖樟
孙
志
袁世山
*
(
中国农业科学院
< br>上海兽医研究所
/
中国动物卫生与流行病学中心上海分中
心
动物传染病防治研究室
农业部动物寄生虫病重点研究室
上海
200232)
摘
要
:
猪繁殖与呼吸综合征病毒是引起猪繁殖与呼吸综合征的病原体
,
本文对
PRRSV
的基因
组结构、病毒的非结构蛋白和结构蛋白的及其功能的分子生物学研究进展做了简要综述。
关键词
:
猪繁殖与呼吸病毒
,
分子生物学
Current Advances on Molecular Biology
of Porcine Reproduc-
tive and
Respiratory Syndrome Virus
WEI Zu-Zhang
SUN Zhi
YUAN Shi-Shan
*
(
Department of Animal
infectious Diseases
,
ShangHai veterinary Research
Institute
,
China Academy of
Agricultural sciences
,
The
Key Laboratory of Animal
Parasitology
,
Chinese
Ministry of Agriculture
,
ShangHai
200232)
Abstract
: Porcine
Reproductive and Respiratory Syndrome virus
(PRRSV) is the etiological agent of
Por-
cine Reproductive and Respiratory
Syndrome. We summarized the recent research
progress on molecular bi-
ology of PRRSV
including the structure of genome, viral
structural and Non-structural protein.
Keywords:
PRRSV
,
Molecular biology, Arterivirus
猪繁殖与呼吸综合征
病毒
(Porcine Reproductive
and
Respiratory Syndrome virus, PRRSV)
与马动脉炎
病毒
(Equine
Arteritis
virus,
EAV)
、小鼠乳酸脱氢酶
升
高症病<
/p>
毒
(Lactate
dehydrogenase-elevating
virus,
LDV)
、以及猴出血
热病毒
(Simian hemorrhagic fever
virus,
SHFV)
同属于动脉
炎病毒属
(arterivirus),
动脉
炎病毒科
(arteriviridae),
套式
p>
(
又称“巢状”
)
病毒目
(Nidovirales)
。
猪
繁
殖
与
呼<
/p>
吸
综
合
征
(PRRS)
是
PRRSV
< br>引起的一种危害严重的接触性传染病
,
俗称
p>
基金项目:
国家自然科学基金
(No.30
530580)
*
通讯作者:
Tel: ,
: shishanyuan@
收稿日期:
2007-06-14;
接受日期
:
2007-09-07
“蓝耳病”
(Blue-eared Disease)
。根据血清型和遗传
特
性
的
差
异
,
可
将
PRRSV
划
< br>分
为
两
个
基
因
型
(Genotype), <
/p>
即欧洲
(
Ⅰ
)<
/p>
型
(
代表株
Le
lystad
viru
s,
LV
)
和美洲
(
Ⅱ
)
型
(
代表株
VR 2332)
。前者主要流行
于欧洲地区
< br>,
而后者主要流行于美洲和亚太地区
[1]
。
该病于上个世纪
80
年
代后期在美国首先被发现
[2]
;
随
后相继在世界各国报道。
1996
年我国郭宝清等人
首次从国内
PRRS
血清阳性猪群中分离到
PRRSV,
证实了我国也有该病的流行
[
3]
。由于没有有效的防
2
微生物学通报
2008,
Vol.35, No.2
制手段
,
PRRS
在国内预演愈烈
,
直接和间接地造成
了
2006
< br>年流行我国大部分省份的所谓“猪无名高
热”
,
又称“猪高热综合征”
[4]
。据粗略估计<
/p>
,
后者
2006
年导致
1000
万-
3000
万头生猪死亡。
PRRS
及并发症防而不止的
原因在于对
PRRSV
的复制过
程
p>
及
致
病
分
子
机
理
不
尽
清
楚
。
< br>本
文
试
图
对
当
前
PRRSV
< br>分子生物学研究进展做一概述
,
以期从根本
上有针对性地防控
PRRS
进行理性思考。
1
PRRSV
基因组的结构
PRRSV
基因组为不分节段的单股正链
RNA,
全长约
15Kb,
具有
5
′
端帽状结构和
3
′
poly(A)
尾。
其
5
′
非
编
码
区
(
又
p>
称
非
翻
译
区
,
untranslated
region,
5′UTR
)
长为
189-222
核苷酸
< br>(nucleotide,
nt),
3
′
末端
UTR
长约
110
-
150nt.
蛋白编码区包含至少八个部
分
首
尾
p>
重
叠
的
开
放
阅
读
框
(Open
Reading
Frame,
ORF),
近
5
′
端占基因组总长四分之三的
ORF1
编码
包括
RNA
依赖性
RNA
聚合酶
(RNA-dependent
RNA
polymerase,
RdRp)
等具有病毒复制与转录功能非结
构
蛋
< br>白
(
Non-Structural
Proteins,
Nsp
), <
/p>
合
称
复
制
酶
(replicase)
和转录酶
(transcriptase)
复合体
(Co
mplex)
。
ORF1
可进一步划分
为
ORF1a
和
ORF1b,
ORF1a
所
编码的复制酶多肽
(polyprotein,pp)pp1a
具有蛋白水
解酶功能
,
位于下游的
ORF1
b
采用
-1
核糖体移码
(-1
ribosomal frameshifting)
机制的表达多聚蛋白
pp1ab
。
据信
,
有两个信号促使核糖体移码的发生
,
第一个
信号是滑动序列
(slippery
sequences),
即
-1
核糖
体的
移
码
位
点
,
在
PRRSV,
< br>这
个
移
码
位
点
一
般
为
GUUUAAAC,
紧跟其后的就是
O
RF1a
的终止密码子
(AUG);
第二个信号位于滑动序列下游的
RNA
假扣
结构
(RNA pseudoknot structure)
。
在
EAV
系统中
,
这
两个信号是
RNA
p>
聚合酶翻译过程中-
1
核糖体移码
所必需的
,
PRRSV
的移码信号尚需试验验证。基因
组近
3
′
端至少有
6
个开放阅读框架编码病
毒的结构
蛋
白
,
结
构
蛋
白
的
表
达
需
要<
/p>
通
过
非
连
续
性
转
录
(discontinuous
transcription)
产生至少六个亚基因组
/wswxtbcn
mRNA(subgenomic
mRNA,
sgmRNA)
。
sgmRNA
与
mRNA1(
亦即病毒基因组
R
NA, vRNA)
共享
5
′
UTR
、
3
′
UTR
以及
poly(A)
。感染细胞中的
RNA
组分按大
小
排列为
mRNA1-7
。除
ORF7<
/p>
外
,
mRNA
在结构上
呈现为多顺反子
(polycistronic),
即每一个下游
ORF
序列都存在于上游
ORF
的
mRNA
分子中。但除
mRNA2
之外
,
每一条
mRNA
在功能上表现为单顺<
/p>
反子
(monocistronic),
即只有位于最上游的
ORF
可
以从一
条
mRNA
中表达
,
而
mRNA2
因同时编码
OR
F2a
和
ORF2b,
则呈现为双顺
反子
(dicistronic)
。
动
脉炎病毒的
5
′
UTR
存在于每条
mRNA
上游的
O
RF
前
,
故又称为前导序列
(Leader)
。
PRRSV
Leader
3
′
< br>末
端
最
后
六
个
碱
基
为
病
毒
种
特
p>
异
性
保
守
序
列
(5
′
-UUAACC-3
′
),
称
为
前
导
序
列
连
接
位<
/p>
点
(leader
junction
site, LJS)
。
这一保守序列同时存在于基因组
中下游的每个
ORF
之前
,
每个下游的
5
′
-UUAACC-
3
′
被
相应地称为编码体序列连接位点
(body
junction
site,
BJS)
。
5
′
UTR
的
LJS
与下游的每个
ORF
前的
BJS
的相互配对
,
从而介导
leader
与下游序列的非
连续性跳跃
(jumpping)
连接。
非连续性连接产生的是
mRNA,
因此这个过程实际上是病毒基因的转录
,
即所谓的“非连续性转录
[1]
。因其参与调节转录过
p>
程
,
故这个六碱基保守序列称为“转录调
控序列”
(transcription-regulating
sequence,
TRS),
或者
转录启
动子
(transcriptional
promoter)
。
2
PRRSV
非结构蛋白及其功能
p>
ORF1a
和
ORF1b
< br>分别编码具有病毒的复制酶
和
RNA
聚合酶功能的两个多聚蛋白
pp1a
和
pp1ab,
pp1a
和
pp1
ab
被
ORF1a
编码的蛋白水解酶加
工成
12
个推测的非结构蛋白
(Non
-structure protein, Nsp)
。
ORF
1a
编码具有多肽蛋白切割功能的蛋白水解酶。
其中
Nsp1
具有木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶活性
(
papain-like
cysteine
proteinse,
PCP),
它能介导自身
从多聚蛋白中切割出来。
Nsp1
包括
PCP1
a
、
PCP1
β
、
锌指
(zinc finger,
ZF)
等三个结构域
, PCP1
a<
/p>
能快速释
韦祖樟等
:
猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展
3
p>
放
N
端
的
切
割
产
物
(Nsp1a),
接
着
P
CP1
β
切
割
Nsp1/Nsp2
位点
,
使
Nsp1
从多聚蛋白中释放出来。
PCP1<
/p>
a
催化位点是
Cys75/His146
,
但
Nsp1a/Nsp1
β
之间具体切割位点还没有定论。
PCP1
β<
/p>
的催化位点
分别为
Cys276/His
345
和
Cys269//His340,
< br>其切割位
点为
Tyr384/Gly385
。
虽然
Nsp1
具有
ZF
结构域
,
但<
/p>
其具体功能还没有确定
[5]
。
Nsp2
具有半胱氨酸蛋白
酶
< br>(
cysteine
proteinse,
CP2
)
活性
[6]<
/p>
,
介导
Nsp2/Nsp3
切割。
CP2
位于
Nsp
2
N
端结构域中
,
在
EAV,
CP2
< br>催
化
位
点
为
Cys271
和
His332,
切
割
位
点
p>
在
Gly831/Gly832,
此催化
位点和切割位点在所有动脉
炎病毒中是高度保守的。
Nsp2<
/p>
在各基因型中和同一
基因型之间变异很大。欧洲型
PRRSV
Nsp2
在
73
4
-
750
位氨基酸之间有一段
l7
个氨基酸的缺失区
,
< br>同为北美洲型的
HB
-
2
株、
BJ
-
4
株、
VR2332
株
和
cH
-
1a
株
,
其
Nsp2
的氨基酸序列同源性在
78
.
3<
/p>
%—
88
.
9<
/p>
%之间
[7]
。而且
Nsp2
蛋白具有耐受
碱基插入或缺失的能力。
HB-2
株在该区存在
12
个
氨基酸缺失现象
, MN184
的
Nsp2
缺失
100
< br>多个氨基
酸
,
而
sp184212
株的
Nsp2
区插入了
30
多个氨基酸
[8][
9]
。因此
Nsp2
可用于监测
PRRSV
的变异的独特
标记。
2006
年-
2007
年我
国大部分省份发生猪高热
综合征
,
从中分离到变异的
PRRSV,
根据动物回归
试验
,
从“高热病”分离的
PRRSV
变异毒株为高致
病性毒株
[10][11]
。
遗传进化分析发现高致病的
PRRSV
Nsp2
p>
存在特异
30
多个氨基酸缺失
,
推测
Nsp2
为高
p>
致病性
PRRSV
的毒力因子
[11]
,
但是目前还没有任
何
试
验<
/p>
证
明
之
。
本
实
验
室
先
后
建
立
了
非
毒
力
的
PRRSV
感染性克隆
pCBC
2
和高致病的
HP
PRRSV
p>
感染性克隆
(
未发表
)
。目前正对强、弱毒株的感染
性克隆的非编码区以及各个结
构蛋白和非结构蛋白
进行相互替换。
特别是对
< br>Nsp2
各个结构域进行系列
的缺失和突变
,
从而剖析
Nsp2
对病
毒复制和转录中
作用。
有趣的是
,
Nsp2
作为一个多功能的蛋白
,
除
了
本身作为半胱氨酸蛋白酶进行自身的水解加工以外
,
该蛋白还存在多个具有高免疫原性的
B
细胞表
位
[12][13]
,
针对这些表位
的抗体能够在感染一周内检测
到。这些免疫表位在免疫应答中的作用还需进一步
研究。
NSP4
具有
3
C
样丝氨酸蛋白酶活性
(3C-like
serine
proteinases,3CLSP),
EAV
3CLSP
是目前研究
相对比较透彻的主要蛋白酶
[14, 15]
。
X-
射线晶体结构
显示
3CLSP
折叠成两个
?
-
桶结构。
?
-
桶结构含有一
个催化中心
(His-1104/Asp-11
30/Ser-1185)
和一个底
物连接袋
< br>(substrate-binding pocket)
构成了典型
3C
样
丝氨酸蛋白酶活性的催化结构域。
在
EAV
复制酶中
,
3CLSP
在
pp1ab
多聚蛋白中至少有
8
个切割位点
,
其中
5
个在
ORF1a
的
C
端
,3
个在
ORF1b
编码的多
肽中。
有四个切割位点是为
Glu/G
ly,
三个是
Glu/Ser,
而另
一个则是
Gln/Ser,
这些切割位点在所有的动脉
炎病毒中都是保守的。
3CLSP
将
ORF1b
编码的多肽
pp1ab
切割成
Nsp9
、
Nsp1
0
、
Nsp11
、
Nsp12
等四个
非结构蛋白
,
这些蛋白形成复制酶复合体
(Replicase
Complex),
同步完成动脉炎病毒基因组的复制和亚<
/p>
基因组转录。
Nsp9
具有
RNA
依赖的
RNA
聚合酶
(RNA-dependent RNA polymerase
,RdRp)
活性
, RdRp
结构域
是
RNA
的复制和转录的引擎。
Nsp
10
由其
C
端的超家族
1(superfamily1, SF1)
解旋酶
(
helicase,Hel)
结构域和
N
端锌结合结构域
(zinc-binding
domain,
ZBD)
组成
[16]
,
具有
A
TP
酶
(ATPase)
和解旋酶活性
。
锌结合结构域对解旋酶功能的行使是必需的
[17]
,
因
为
ZBD
中的单个残基的替代或整个结构域的缺失
可致
Nsp10
功能失活
,
而且失活的<
/p>
Nsp10
功能不能
被野型
ZBD
反式互补
(in
trans
),
说明
ZBD
在
Nsp10
也起到顺
式
(in
cis
)
调控功能的作用。故可以推测
ZBD
通
过
某
种
未
知
的
机
制<
/p>
调
节
解
旋
酶
活
性
,
在
PRRSV
的复制和转录中起着关键作用。<
/p>
Nsp11
具有
套式病毒特异的核糖核酸
内切酶
(Nidovirus-specific
endoribonuclease,Nendo U)
功能蛋
白结构域。
NendoU
是套式病毒
(
Nidovirales)
复制酶
C
端
的最保守区域
,
在冠状病毒中
, N
endoU
是
Mn
2
< br>+
依赖性的
,
能产生
2
′
-
3
′
环状磷酸化末端和切割
GU
或
GUU
序列中的尿
苷酸
,
具有催化作用的三个残基
(His-162,
His-178,
/wswxtbcn
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