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SiRNA
序列的设计
RNAi
最终要通过
siRNA
片段与靶基因结合并使之降解,因此,确保高度同源于靶基因而绝无
与
其他基因同源的
siRNA
序列,是
决定
RNAi
特异性的关键所在,也是
siRNA
设计的基本原则。从
具有不同沉默效率的
siRNA
序列中筛选出高效的
siRNA
序列,需要经过严密的设计和不断的实
验检验
[1]
。
1.1
siRNA
序列在靶基因中的位置
从靶基因起始密码子
AUG
下游
50
~
100
个核苷
酸开始搜寻理想的
siRNA
序列,
越
靠近靶基因的
3′
端,其基因沉默效果可能越好
[2]
。以前的研究表明:不要以
5
< br>′
非翻译区(
5′UTR
)和<
/p>
3′
非翻
译区(
3′UTR
)及起始密码子附近序列作为设计
siRNA
的模板,这些区域含有调节蛋白结合位点
(
如
翻译起始复合物
)
,调节蛋白可与
RI
SC
竞争结合
siRNA
序列,降低<
/p>
RNAi
效应
[3]
;也要避开
外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性
(
SNP)
区域。最近,
Yokota
等
发现在
HCV(
丙型肝
炎病毒
)
基因组中,
5′UTR
是一个高度保守区,
使之成为
siRNA
理想的靶点。
运用
RNAi
技术作
用
于
5′UTR
或
3′UTR
序列,同样可引起靶基因沉默
[4,5]
,这些发现使基因功能分析领域扩展到
5
′U
TR
和
3′UTR
内。
1.2
siRNA
序列的起始碱基与长度
SiRNA
序列最好为
AA(N
n)UU(N
代表任意碱基;
n
为碱
基数目,在
19
~
29
nt
之间
)
,
NA(N n)
UU
和
NA(N n)
NN
序列也可以。以前的研究表明,典型
siRNA
的三大结构特征是:长度为
21
~
23 nt
;
siRNA
双
链的
3′
端各有两个突出碱基;
siR
NA
双链的
5′
端有磷酸基团。以
p>
AA
N19
标准
设计的
siRNA
,在哺乳动物细胞中
70%
~
80%
可产生
RNAi
作用。但是一些具有较小脱靶效应
的
siRNA
序列不是以
AA
< br>为起始的,所以现在不推荐以
“AA
为起始
”
作为选择标准之一
[6]
。最新
研究表明
[7,8]
,
27
nt
或
29 nt
的
< br>siRNA
与
21 nt siRNA
< br>相比:
(
1
)
< br>其抑制活性可提高数倍以上;
(
2
)不易于诱导干扰素反应和激活
PKR
;
(
3
)一些基因对
21 nt
siRNA
不敏感,但是可以被
27
nt siRNA
有效的抑制;
(
p>
4
)与
21 nt
SiRNA
相比,
27 nt SiRNA
对靶基因的最大抑制率可在相对
低的浓度下得到。另外,在选择
siRNA
序列时,要考虑到所用启动子的类型。
U6<
/p>
启动子要求转
录产物的第一个碱基是
G<
/p>
,正反义链均如此;
H1
启动子转录产物
的第一位碱基为
U
、
G
、
C
均不
影响基因的沉默效果
[9]
。
1.3 siRNA
3′
端突出碱基的选择
当
siRNA
的
3′
端突出碱基为
UU
时,其基因
抑制效率最高;但是
3′
端的突出碱基不能为
< br>G
,因
为
RNase
会降解以
G
为末尾的
RN
A
单链。
Elbashir
等[
p>
2
]建议用
dTdT
取代
3′
端的
2
个碱基
突出,增强
siRNA
双链复合体的稳定性。需要注意的是,由于双链
siRNA
中的正义链不参与对
靶
mRNA
< br>的识别,所以正义链的
3′
端突出碱基可以用
dTdT
替代,但是反义链
3′
< br>端突出碱基必
需与靶
mRNA
序
列相同的。
1.4
siRNA
序列中
G/
C
含量的选择
在
siRNA
序列中,
G/C
含量的选择比确定以
AA
为起始的序
列更重要。具有均衡碱基含量
(
即
G/
C
含量在
30%
~
70% )
的序列可以作为
siRNA
< br>候选序列;
而具有较低
G/C
含
量
(
30%
~
52%
)
1
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