-
RNA
沉默技术及其在植物中的应用
摘要
:
RNA
沉默是广泛存在于生物中的一种古老现象
,
是生物抵抗异常
DNA
的一种保护机
制
,
同时在生物生长发育过程中扮演着基因表
达调控的角色。文章对
RNA
沉默研究中的几
< br>个热点问题进行了介绍
,
按
RNA
沉默持续时间的不同对其在植物中应用的方法进行了分
析
,
并重点论述了
RNA
沉默在植物功能基因组研究、作物品质改良以及抗病毒植物培育等
方面的应
用及其发展前景。
关键词
:
RNA
沉默
;
RNA
干扰
;
功能基因组
;
作物品质改良
;
抗病毒植物
RNA
沉默
(RNA silenc
ing)
是一种结合和降解特异
mRNA
序列的形式
,
其发现可追溯到
1
990
年
, Napoli
等
[1]
向矮牵牛中导入更多拷贝与粉红色色素合成有关的基因以产生颜
色更
深的紫色矮牵牛花
,
结果许多花朵的颜色不但没有加深
,
反而变成白色或花白色。因为导入
的基因和其同源的内源基因同时都被抑制
,
所以被称为共抑制
(co-suppres
sion)
现象。另
外
,
这
种
共
抑
制
现
象
被
< br>确
认
是
发
生
在
转
录
后
水
平
,
所
以
又
被
称
为
转
录
后
基
因
沉
默
(post- transcrip-tional gene silencing, P
TGS)
。
随后发现在真菌中的消除
(
quelling)
现象以
及动物的
R
NA
干扰
(RNA interference, RNA
i)
现象都属于
RNA
沉默。另外
, Makarova
等
[2]
在最近的研究发现
,
在原核生物中同样存在
着类似真核生物的
RNA
沉默机制。
RNA
沉默自发现以来
,
迅速的成为生物学研究的热点。不论对其机制的研究还是作为一种
基因表
达抑制技术的应用
, RNA
沉默都取得了巨大的成功。
本文简要介绍了
RNA
沉默的产
生机制及植物
RNA
沉默的特异性、
RNA
沉默的技术特点及其与
RNA
介导的
DNA
甲基化
的关系等
研究热点
,
并系统论述了
RNA<
/p>
沉默技术在植物中的应用。
本文还对
RNA
沉默技
术的操作技术和应用领域
进行了阐述
,
并对
RNA
沉默的在植物中的应用前景进行了展望。
1
RNA
沉默研究中的几个热点问题
1.1
RNA
沉默的产生及其基本机制
<
/p>
RNA
沉默是存在于生物中的一种古老现象
,
是生物抵抗异常
DNA(
病毒
、
转座因子和某些高
重复的基因组序列
)
的保护机制
,
同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色
,
它可
以通过降解
RNA
、
抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用
[3]
。
RNA
沉默存在两种既有联系
又有区别的途径
: siRNA(small interference
RNA)
途径和
miRNA(microRNA)
途径。
siRNA
途径是由
dsRNA(double-stranded
RNA)
引发的
, dsRNA
被一
种
RNase
Ⅲ家族的内切核酸
酶
(RNA- induced silencing complex,
Dicer)
切割成
21~26
nt
长的
siRNA,
通过
siRNA
指
导形成
RISC
蛋白复合物
(RNA-induced
silencing complex)
降解与
siRNA<
/p>
序列互补的
mRNA
而引发
RNA
沉默。
而
miRNA
途径中
miRNA
是含量丰富的不编码
小
RNA(21~24
个
核苷酸
),
由
Dicer
酶切割内源性表达的短发夹结构
RNA(hairpin RNA, hpRNA
)
形成。
miRNA
同样可以与蛋白因
子形成
RISC
蛋白复合物
,
可以结合并切割特异的
mRNA
而引发
RNA
沉默
[4]
。尽管引发沉默的来源不同
,
但
siRNA
和
miRNA
都参与构成结构相似的
RISC,
在作用方式上二者有很大的相似性。
1.2
RNA
沉默在植物与其他生物中的差异
尽管不同生物的
RNA
沉默机制相似
,
但植物与其他生物相比有其特异性。首先
,
在植物中
存在系统性沉默
(systematic
RNA silencing)
现象
,
RNA
沉默不会局限于单个细胞内
,
可以
在细胞与细胞之间、甚至由诱导部位向更远的组织传播。其次
,
植物中存在转移性沉默
(transitive
RNAi),
对于转基因植物中的外源基因
,
如果
dsRNA
诱导的
RNA
沉默区域对应
于基因的中间区域
,
能检测到与其侧翼区段对应的
siRNA
。但内源基因却缺乏转移性沉
默
,
表现出沉默区域的保守性
[5,6]
。这两种现象在线
虫中也有发现
,
但在哺乳动物和昆虫中
却没有发现类似的现象。最后
,
植物中的
RNA
沉默跟两种不同大小的
siRNA
有关
: 21
nt
和
24 nt siRNA, 21 nt
由
RISC
指导切割目的
mRNA,
而
24
nt
则引发了系统性沉默和甲
基化
;
而在动物中仅发现
21 nt
的
siRNA
。
1.3
RNA
沉默与其他基因表达抑制技术的比较
RNA
沉默属于一种基因表达抑制技
术
,
能够使基因的表达受到抑制甚至完全不表达。基因
表达抑制技术从作用机理上可分为
DNA
水
平上的抑制
(
基因打靶、转座子标签和
T-DNA
插
入等
)
< br>、转录水平上的抑制
(
调控区甲基化等
< br>)
和转录后水平上的抑制
(
反义
RNA
和
RNA
沉默
等
),
在基因功能研究中
, RNA
沉默与
其他几种基因表达抑制技术相比有明显的优越性。首
先
, <
/p>
它比反义
RNA
技术效率更高
,
能在低于反义
RNA
几个数量级的浓度下使目标基因表达
降到极低的水平甚至完全
“
剔除
”,
因此更容易产生功能降低甚至缺失的突变
;
其次
,
与
T-DNA
和转座子标签技术相比
,
不存在插入位点随机性的问题
,
理
论上任何基因都可被针
对性的
dsRNA
特异性沉默
;
最后
,
应用同源重组进行的基因敲除效率非常低
,
且打靶载体
构建所需的同源序列较长
,
而
RNA
沉默高效并且需要的同源序列
则较短。
Wesley
等
[7]
利
用
hpRNA
载体
产生的
RNA
沉默
, 98 bp
长的同源序列即可产生有效地
RNA
沉
默。
1.4 RNA
沉默与
RNA
介导
D
NA
甲基化
植物中
, dsRNA
不仅诱导
RNA
沉默的产生
,
< br>而且还可以诱导产生序列特异性的
DNA
甲基
化
(RNA-directed DNA methylation,
RdDM)
。针对启动子区域设计的
dsRNA
产生了启动
子甲基化
,
这
导致染色体构象的变化并影响了转录因子结合启动子的能力使转录效率降低。
dsRNA
被降解为长约
23 nt
的
siRNA
揭示了它进入了一条跟
PTGS
中的
dsRNA
同样的途
< br>径
[8,9]
。
RdDM<
/p>
是一个非常特殊的过程
,
甲基化主要局限于
RNA-
DNA
序列相同的部分
,
很
少向临近序列扩散
,
这一种显著的特异性揭示了
RNA-DNA
碱基配对为甲基化提供了基础。
RdDM
也是一个精细的过
程
,
能够使
DNA
产生甲基化的
RNA
长度约为
30 nt
。
RdDM
产生
了一个不寻常的甲基化模式
:
在保守的
CG
区和其他序列胞嘧啶也被甲基化
[10
]
。
2
RNA
沉默在植物中应用的方法
<
/p>
目前
RNA
沉默的应用在动植物中采用的
方法差异较大
,
在动物中由于长链的
dsRNA
诱导
PKR
途径非特异性
降解
dsRNA[11],
因此动物研究一般采用
siRNA
的方式产生基因沉
默
;
而在植物中由于细胞壁的限制
,
使注射、饲喂等方法将
siRNA
导入植物细胞内
非常困
难
,
因此植物中普遍采取<
/p>
dsRNA
的方式产生
RNA
沉默。
常用的
RNA
沉默
技术按引起
RNA
沉默持续时间的不同可分为瞬时性的
RNA
沉默和持久的
RNA
沉默
[12]
。
2.1
瞬时性的
RNA
沉默
导致产生瞬时性
RNA
沉默的方法包括基因枪轰
击法和病毒侵染法。基因枪轰击法是利用金
弹或钨弹颗粒包裹设计好的
< br>DNA
或载体来轰击目标植物组织获得
RNA
沉默的方法
,
尽管
基
因枪法也能产生持久性的转基因效应
,
但在
RNA
沉默中它更多的应用于瞬时性的
RNA
沉默研究。用该方法对植物的转化速度快
,
并且当
DNA
进入目标组织后就会被释放并迅速
表达
dsRNA
而产生
RNA
沉默现象。
Schweizer
等
[13]
通过基因枪轰击谷物如小麦、
玉米
和
大麦的叶片表皮细胞将表达
dsRNA
或
hpRNA
的
DNA
结构转化入植物并引发
RNA
沉默
< br>,
这
种方法已经在沉默内源基因
A1
、
MLO
、
< br>GUS
基因中得到证实
,
表
现为目标基因活性的降低。
Klahre
等
[14]
发现通过用携带
dsRNA
、
siRNA
和一个表达单链
GFP
基因
RNA
的质粒载体
的微弹颗粒轰击转
GFP
基因烟草能够沉默
GFP
基因的表达。
在转
GUS
基因烟草中通过基
因枪介导的
d
sRNA
、
siRNA
和正义、反义<
/p>
RNA
轰击以使
GUS
< br>抑制蛋白沉默
,
发现每种方
法都能产生
siRNA
而导致
GUS<
/p>
抑制蛋白的沉默
,
结果使
GUS
能正常表达。
病毒诱导的基因沉默
(virus induced
gene silencing, VIGS)
是通过改造侵染植物的病毒使
其携带用于产生
RNA
沉默的
DNA
序列
,
当用该病毒
侵染植物时则产生
RNA
沉默现象。
K
umagal
等
[15]
将人工构建的
植物基因
PDS
的片段插入烟草花叶病毒基因组中使其产生包<
/p>
含正向或反向
PDS
序列片段的
RNA
时产生了光褪色现象
,
揭示内源的
PDS
基因被沉默。
利用马铃薯
X
病毒
[16]
和烟草
rattle
病毒
[17]
发展了一种高效、精确的病毒诱导的基因沉默
系统
。尽管很多病毒诱导的基因沉默系统往往利用
RNA
病毒
,
但许多通过在终止子处发生
通读而表达
dsRNA
的
DNA
< br>病毒也被开发并被证明能够有效地产生
RNA
沉默现象<
/p>
[18,19]
。
通常进行
VIGS
< br>时利用目的基因的
300~800
bp
片段可达到很好的沉默效果
,
但片段长度在
23~60 bp
时也
被证实是有效的
[20]
。利用不同的
VIGS
载体对于报告基因
GUS
或<
/p>
GFP
或
内源的
PDS
基因都得到很好的沉默效果。
而利用
TRV-VIGS
载体报道了大量内源基因的沉
默
,
尤其在抗病性和乙烯信号途径中的发挥作用的基因。并且
TRV
病毒对几乎所有的植物
组织具有较好的侵
染能力
,
这些因素使
TRV-VI
GS
载体拥有更大的潜在发展空间
[21]
。
2.2
持久性的
RNA
沉默
目前
,
在植物中持久表达
RNA
沉默通常采用构建表达载体
,
通过
PEG
介导、
电穿孔介导、
农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。
由于农杆菌侵染法技术的
成熟
,
在持久性的
RNA
沉默研究中得到了广泛应用。<
/p>
对于
RNA
沉默的持久性
, Stoutjesdijk
等
[22]
报道拟南芥中到
T5
代时
RNA
沉默仍然是遗传稳定性的。构建
hpRNA
高效表达载体
用于特定基因沉默是研究的热点之一。
Wesley
等
[6]
系统研究了不
同结构的
RNA
对沉默效
率的影响
,
发现相比于单链正义或反义
RNA,
双链
RNA
尤其是发夹式结构的
RNA(hpRNA)
对
RNA
沉默的效率有非常显著的提高。如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码
序
列
如
内
含
子
,
在
植
物
体
内
转<
/p>
录
形
成
含
内
含
子
的
发
卡
结
构
(intron splicing hpRNA, ihpRNA),
则沉默效果与
hpRNA
相比可从
58%
提高到
90%
。
hpRNA
载体设计过程中
,
靶基因反向重复片段的长度和位置将影响基因沉默的效率。植物
中一
般采用几百
bp
的靶基因片段构建载体
, Matzke
等采用大约
300 bp
的
Nos
启动子序列
反向重复
形成的
dsRNA
与
273 bp<
/p>
的环就足以诱导产生有效的
RNA
沉默。
Chuang
等
[23]
采用
288~409
bp
的序列片段
,
也获得良好的抑
制基因表达效果。
一般认为靶基因序列应选
择基因编码区片段<
/p>
,
但
Stoutjesdijk
等
[22]
采用
F
AD2
基因的
5′
UTR
片段也有效地沉默了
该基因。
Brum
mell
等
[24]
将农杆菌的
3' UTR
序列的反向重复片段连接于多聚半乳糖醛酸
酶
(PG)
基因片段用于番茄转化
, 91%
的植株表现出
PG
基因抑制现象
,
成熟果实中
PG
的
mRNA
含量
降低
98%
以上。
早先设计的
RNA
< br>沉默载体一般选用强的组成型启动子如
35S CaMV
启动子
(
对于双子叶植
物
)
或玉米
ubiquitin1
< br>启动子
(
对于单子叶植物
)
启动
dsRNA
或
ihpRNA
的表达。当对目的基
因的沉默表现出致死性状时<
/p>
,
则需要构建诱导型的基因沉默载体。在植物诱导型表达系统
中
,
几个由化学物质
(
四环素、铜、乙醇和类固醇等
)
< br>响应的载体已被报道
,
其中一个比较有
效的启动子系统是基于菌类
Aspergillus nidulans<
/p>
的
alc
基因开关。它是由乙醇诱导的<
/p>
,
当
存在乙醇时
AlcR
结合到修饰的
alcA
启
动子区域并使沉默区段得到表达
,
除去乙醇则表达被
终止。研究证明
alc
沉默系统在拟南芥、烟
草、马铃薯块茎中均有较高的效率
[25]
。然而应
用化学物质作为诱导剂可能产生生长扰乱
,
例
如糖皮质激素诱导系统就可能扰乱植物的正
常生理活动。对拟南芥
HSP18
基因的研究
[26]
发现
在植物中它可以作为一个有效的热激诱
导系统
, Mascl
aux
等
[27]
应用来自拟南芥的<
/p>
HSP18
启动子构建了几个热激诱导的基因沉默
系统。
与组成型
CaMV35S
启动子构建的基因沉默系统相比
,
该系统成功的沉默了内
源
PDS
基因并表现出热诱导的特性
,
为其应用打下了基础。
3
RNA
沉默在植物中的应用领域
3.1
RNA
沉默在植物功能基因组研究中的应用
后基因组时代的重要挑战是揭示基因组中所有基因的功能。<
/p>
分子生物学研究中经常采用减少
或失活基因表达
< br>,
通过对表型的观察来确定基因的功能。
插入突变在
这种研究中是一个非常
有用的工具。
两种插入突变的策略
, T-DNA
和转座子标签
,
已经在拟南芥中取得大规模应用
并以此产生了几个大的公共拟南芥插入
突变体库。
尽管这些突变体库提供了非常好的研究材
料
,
但通过这些方法得到的插入突变有几个缺点
,
如不能应用于多拷贝基因的研究、对基础
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