-
近年来的研究表明
,
一些短片断的双链
RNA
可以通过促使特定基因的
mRNA
降解来高效、
特异的阻断体内特定基因表达
,
诱使细胞表现出特
定基因缺失的表型
,
称为
RNA
干扰（
RNA
interference,RNAi
）
.siRNA
（
small
interfering RNAs
）就是这种短片断双链
RN
A
分子
,
能够以序列
< br>同源互补的
mRNA
为靶目标
,
降解特定的
的发现具有划时
代的意义
,
它不仅深入揭示
了细胞内基因沉默的机制
,
而且它
还是后
基因组时代基因功能分析的有力工具
,
< br>极大地促进了人类揭示生命奥
秘的进程
.
现在越来越多的研究人员开始采用
RNAi
来研究生
物体的
基因表达
.RNAi
技术可广泛
应用到包括功能基因组学
,
药物靶点筛选
,
细胞信号传导通路分析
,
疾病治疗
等等
.
目前为止较为常用的
5
种制备
siRNAs
的方法包括：
·
化学合成
·
体外转录
·
长片断
dsRNAs
经
RNase III
类降解
(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·
siRNA
表达载体或者病毒载体在细胞中表达<
/p>
siRNAs
·
PCR
制备的
siRNA
表达框在细胞中表达
获得高纯度的
siRNA
产
物是进行实验的第一步
,
而转染的效率则是非
< br>常关键的因素
.
一、基本概念
RNAi
：
（
RNA interference
）
RNA
< br>干扰
内源性或外源性双链
RN
A(dsRNA)
介导的能诱导细胞内与其序列同源
的特异基因
表达沉默或抑制的效应
,
诱使细胞表现出特定基因缺失的
表型
,
称为
RNA<
/p>
干扰
,
它也是体内抵御外在感染的一种重
要保护机制
.
siRNA
：
(small interfering
RNAs)
小干扰
RNA
由长
dsRNA
裂解而成的一种
19-25nt<
/p>
的短片断双链
RNA
分子
,
能够以
同源互补序列的
RN
A
为靶目标降解特定的
mRNA,
RNAi
的关键效应分
子
.
shRNAs:(small hairpin RNA
)
小发夹
RNA
是设计为能够形成发
夹结构的非编码小
RNA
分子
,shR
NA
需通过载体
导入细胞后
,
然后利用细胞内的酶切机制得到
siRNA
而最
终发挥
RNA
干扰作用
.
Dicer
：属于
RNase
Ⅲ
家族
,
是
dsRNA
的特异性核酸内切酶
RISC
：
(RNA-
inducing silencing complex) RNA
诱导的沉默复合体
,
具有核
酸内切、外切以及解旋酶活性
二、机制
目前普遍认为
,
共抑制、
基因压制和<
/p>
RNAi
很可能具有相同的分子机制
,<
/p>
都是通过
dsRNA
的介导而特异地降解
靶
mRNA,
抑制相应基因的表达
.
即
RNAi
、共抑制、
quelling
均属于
PTGS
！现已初步阐明
dsRNA
介导
的
同源性靶
mRNA
降解过程主要分为两步
.
第一步（起始阶段）是较长
ds
RNA
在
ATP
参与下被
RNase
Ⅲ样的特
异核酸酶切割加工成
21~23nt
的由正义和反义链组成的小干扰
RNA
（
small interfering
RNA,siRNA
）
.
第二步（效应阶段）是
siRNA
在
ATP
参与下被
RNA
解旋酶解旋成单
链
,
并由其中
反义链指导形成
RNA
诱导的沉默复合体
(RNA-induced
silencing complex,RISC).
RNAi
途径主要存在于细胞浆中
,<
/p>
但是
siRNA
产生、靶
mRNA
降解的亚
细胞位置尚未明确
< br>.
外源性（注射或喂养）的
dsRNA
< br>和病毒性
dsRNA
可能可以直接进入细胞浆中的
RNAi
途径
,
仅在
细胞浆中复制的
RNA
病
毒可被
dsRNA
介导的沉默机制所抑制
.
外源性
dsRNA
则还可导致细胞
核中的同源早期
RNA
转录产物减少
.
在许多机体中反向重复转基因序列在细胞核内转录成发夹
dsRNA,
进
而可介导
RNAi,
这种
dsRNA
可能需要转移至胞浆中才可有效地沉默同
源靶
mRNA.
RNAi
的放大效应机制
siRNA
不仅可引导
RISC
< br>切割靶
RNA,
而且可作为引物在
RNA
依赖的
RNA
聚合酶
(RdRP)
作用下以靶
mRNA
为模板合成新的
dsRNA.
新合成的长链
dsRNA
同样可被
RNase
Ⅲ样核酸酶切割、
降解而生成大
量的次级
siRNA.
次级
siRNA
又可进入合成
-
切割的循环过程
,
进一步放
大
RNAi
< br>作用
.
这种合成
-
切割的循环过程称为随机降解性
PCR
（
random
degradative
PCR
）
.
三、
RNAi
表达载体的构建
1.
目的基因的确定
（
< br>1
）
、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
（
2
）
、
/
（
3
）
、
/ or
2
、设计
siRNA
靶序列
在制备
siRNA
前都
需要单独设计
siRNA
序列
.
研究发现对哺乳动物细
胞
,
< br>最有效的
siRNAs
是
21-
23
个碱基大小、
3’
端有两个突出碱
基的双链
RNA
；
而对非哺乳动物
,
比较有效的是长片段
的序列专一
性要求非常严谨
,
与靶
mRNA
之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉
默的效果
.
（
1
）
、选择
siRNA
靶位
点：
从转录
AUG
< br>起始密码子开始
,
搜寻下游
AA
序列
,
记录跟每个
AA 3’
端相
邻的
19
个核苷酸作为候选的
siRNA
靶位点
.
有研究结果显示
GC
含量
在
30%
—
50%
左右的
siRNA
要比那些<
/p>
GC
含量偏高的更为有效
.
Tuschl
等建议在设计
siRNA
时不要针对
5'
和
3'<
/p>
端的非编码区（
untranslated
regions,UTRs),
原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域
,
而这些
UTR
结合蛋
白或者翻译起始复合物可能会影响
siRNP
核酸内切酶复合<
/p>
物结
合
mRN
A
从而影响
siRNA
的效果
.
（
2
）
、序列同源性分析
:
将潜在的序列和相应的基因
组数据库（人
,
或者小鼠
,
大鼠等等）进行
比较
,
排
除那些和其他编码序列
/EST
同源的序列
.
例如使用
BLAST
（
/BLAST/
）
选
出合适的目标序列进行合成
.
并非
所有
符合条件的
siRNA
都一样有效
,<
/p>
其原因还不清楚
,
可能是位置效应
的结果
,
因此对于一个目的基因
,
一般要选择
3-5
个靶位
点来设计
siRNA.
通常来说
,<
/p>
每个目标序列设计
3
—
< br>4
对
siRNAs,
选择最有效
的进行后续研
究
.
（
3
）
、设计阴性对照：