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RNA
干扰
（
RNAi
）实验原理与方法
近年来的研究表明，将与
mRNA
对应的正义
RNA
和反义
RNA
< br>组成的双链
RN
A(dsRNA)
导入细胞，
可以使
mRNA
发生特异
性的降解，
导致其相应的基因沉默。
这种转录后基因沉默机制<
/p>
(post-transcriptional
gene
silencing,
PTGS)
被
称为
R
NA
干扰（
RNAi
）。
一、
RNAi
的分子机制
通
过生化和遗传学研究表明，
RNA
干扰包括起始阶段和效应阶段
(inititation
and
effector
steps)
。在
起始阶段，加入的小分子
RNA
被切割为
21-23
核苷酸长的
小分子干扰
R
NA
片段
(small
interfering
RNAs,
siRNAs)
。证据表明；一个称为
Dicer
的酶，是
RNase
III
家族中特异识别双链
RNA
的一员，它能以一种
ATP
依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，
病毒感染等各种方式引入的双链
RNA
，切割将
RNA
降解为
19-21bp
的双链
RNAs(siRNAs)
，每个片段的
3’
端都
有
2
个碱基突出。
在
RN
Ai
效应阶段，
siRNA
双链结合一
个核酶复合物从而形成所谓
RNA
诱导沉
默复合物（
RNA-induced
silencing
complex,
RISC
）。激活
RISC
需要一个
A
< br>TP
依赖的将小分子
RNA
解双
链的过程。
激活的
RISC
通过碱基配
对定位到同源
mRNA
转录本上，并在距离
siRNA3’
端
12
个碱基的位置切割
mRNA
。尽管切
割的确切机制尚不明了，但每个
RISC
都包含一
个
siRNA
和一个不同于
Dicer
的
RNA
酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的
dsRNA
在植物体内同样被切割成
21-23nt
长的片段
,
这种
dsRNA
可使内源相应的
DNA
序列甲基化
,<
/p>
从而使启动子失去功
能
,
使其下游基因沉默
.
二
、如何进行
RNAi
试验
(
一
)si
RNA
的设计
1.
在设计
RNAi
实验时，可以先在以下网站进行目标
序列的筛选：
/business/products/
/techlib/misc/siRNA_
/Stu/shilin/
/rnadesign/?SID=45358710
目标序列的选取原则：
(1)
从转录本（
mRNA
）的
AUG
起始密码开始，寻找
“A
A”
二连序列，并记下其
3
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/p>
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'
端的
19
个碱基序列，
作为潜在的
siRNA
靶位点。
有研究结果显示
GC
含量在
4
5%
—
55%
左右的
siRNA
要比那些
GC
含量偏高的更为有效。
Tuschl
等建议在设计
siRNA
时不要针对
5'
和
3'
端的非编码区（
untranslated
re
gi
ons
，
UTRs)
，
原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些
UTR
结合
蛋白或者翻译起始复合物可能会影响
siRNP
核酸内切酶复合物结合
mRNA
从而
影响
siRNA
的效果。
(2)
将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小
鼠，大鼠等等）进行比较，
排除那些和其他编码序列
/EST<
/p>
同源的序列。
例如使用
BLAST
（
/BLAST/
）
(3)
选出合适的目标序列进行合
成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的
siRNA
，
以找到最有效的
siRNA
序列。
3.
阴性对照
一个完整的
siRNA
实验应该有阴性对照，
作为阴性对照的
siRNA
应该和选中的
siRNA
序列有相同的组成，但是和
mRNA
没有明显的同源性。通常的做法是
将选
中的
siRNA
序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细
胞中其他基因
没有同源性。
4.<
/p>
目前已证实的
siRNA
可以在下面的网
页找到：
/catalog/?key=49
/techlib/tb/tb_
/mmcmanus/www/
/
Order_Entry/jsp/?Categor
y=Published
(
二
)siRNA
的制备
目前为止较为常用的方法有
通过化学合成，体外转录，长片断
dsRNAs
经
RNa
se
III
类降解
(e.g.
Dicer,
E.
coli,
RNase
III)
体外制备
siRNA
，以及通过
siR
NA
表达载体或者病毒载体，
PCR
< br>制备的
siRNA
表达框在细胞中表达产生
siRN
A
。
体外制备
1.
化学合成
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成
siRNA
。主要的缺点
包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他
方法高，为
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一个基因合成
3
—
4
对
< br>siRNAs
的成本就更高了，
比较常见的做法是用其
他方法
筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的
siRNA
的情况下，
需要大量
siRNA
进行研究
不适用于：筛选
siRNA
等长时间的研究，主要原
因是价格因素
2.
体外转录
以
DNA
Oligo
为模版，通过体外转录合成
siRNAs
，成本相对化
学合成法而言
比较低，而且能够比化学合成法更快的得到
siR
NAs
。不足之处是实验的规模受
到限制，虽然一次体外转录合
成能提供足够做数百次转染的
siRNAs
，但是反应
规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相
当的时间。值得一提的是体外转录得到的
siRNAs
毒性
小，稳定性好，效率高，
只需要化学合成的
siRNA
量的
1/10
就可以达到化学合成
siRNA
所能达到的效
果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选
siRNAs
，特别是需要制备多种
siRNAs
，化学
合成的价格成为
障碍时。
不适用于
：实验需要大量的，一个特定的
siRNA
。长期研究。
3.
用
RNase
III
消化长片断双链
RNA
制备
siRNA
其他制备
siRNA
的方法的缺陷是需要设计和检验多个
siR
NA
序列以便找到一个
有效的
siRN
A
。而用这种方法
——
制备一份混合有
各种
siRNAs
“
混合鸡尾酒
”
就可以避免这个缺陷。
选择通常是
200
< br>—
1000
碱基的靶
mRNA<
/p>
模版，
用体外转
录的方法制备长片断双链
dsRNA
，然后用
RNase
III
(or
Dicer)
在体外消化，
得到一种
siRNAs“
混合鸡尾酒
”
。在除掉没有被消化的
dsRNA
后，这个
siRNA
混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的
siRNA
转染一样。由于
siRNA
混合
物中
有许多不同的
siRNAs
，通常能够保证目的基因被有效地抑
制。
dsRNA
消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效
si
RNA
序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：
通常用
RNAse
III
通常比用
Dicer
要便宜）
。不过这种方
法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，
特别是同源或者是密
切相关的基因。
现在多数的研究显示
这种情况通常不会造成影响
。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的
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siRNA
进行研究，特别是基因治疗
体内表达
前面的
< br>3
种方法主要都是体外制备
siRNAs
，并且需要专
门的
RNA
转染
试剂将
siRNAs
转到细胞内。而
采用
siR
NA
表达载体和基于
PCR
的表达框架则属于：从转染到
细胞的<
/p>
DNA
模版中在体内转录得到
siRNA
s
。这两种方
法的优点在于不需要直接操作
RNA
。
4.
siRNA
表达载体
多数的
siRNA
表达载体依赖三种
RNA
聚合酶
III
启动子
(pol
III)
中的一种，操纵一段小的发夹
RNA(short
hairpi
n
RNA,
shRNA)
在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动
子包括大家熟悉的人源和鼠源的
U6
启动子和人
H1
启动
子。
之所以采用
RNA
pol
III
启动子是由于它可以在哺乳
动物细胞中表达更多的小分子
RNA
，而且它是通过添加
一串（
3
到
6
个）
U
来终止转录的。要使用这类载体，需
要订购
2
段编码短发夹
RNA
序列的
DNA
单链，退火，
克隆到相应载体的
pol
III
启动子下游。
由于涉及到克隆，
这个过程需要几周甚至数月的时间，
同时也需要经过测序
以保证克隆的序列是正确的。
siRNA
表达载体的优点在于可以进行较长期研究
——
带
有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基
因的表
达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于
siRNA
表达，其优势在于可以直接高
效率感染细胞进行基因沉默的研究，
避免由于质粒转染效
率低而带来的种种不便
,
而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的
siR
NA
序列，需要维持较长
时间的基因沉默。
不适用于：筛选
siRNA
序
列（其实主要是指需要多个克
隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5.
siRNA
表达框架
siRNA
表达框架
(siRNA
expression
cassettes
< br>，
SECs)
是一种由
PCR<
/p>
得到的
siRNA
表达模版，
包括一个
RNA
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