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miRNA
常用实验方法
一、
miRNA
的检测方法
miRNA
的
realtime-
PCR
检测方法
1
、
realtime-PCR
引物设计
miRNA realtime-
PCR
引物设计方法：
1
）
stem-loop
RT
引物设计：基于通用的茎环结构，只需要按照不同的
< br>miRNA
序列修改最末
端
6<
/p>
个碱基即可。
通用茎环结构序列为：
GT
CGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
例如设计
miR-1
（
UGG
AAUGUAAAGAAGUAUGUAU
）
的
RT
引物，
只需在通用茎环序列后架上
miRNA3’
末端的
6
个碱
基的反向互补序列，即
GTCGTATCCAGTGCAGG
GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC
ATACAT
2
）
realtime
上游引物设计：
miRNA
序列除去
3’端
6
个碱基的剩余部分作为上游引物，如
miR-1
的上游引物为
(
注意把
U
改为
T)
：
TGGAATGTAAAGAAGT.
检查引物的<
/p>
Tm
值（一般参考
DNAMAN
）
，如果
Tm
值较低，
则在
5’端加
GC
使
< br>Tm
值接近
60
度。因此
miR-1
的上游引物可
设计为：
GCGCTGGAATGTAAAGAAGT
，
6
1.4
度。
3
）下游引物是通用的，序列为
GTGCAGGGTCCGAGGT
。
4
）引物设计好后，需要通过
预试验检测引物的特异性。一般需要做溶解曲线来检测引物的
特异性；同时最好将
PCR
产物进行电泳检测产物是否单一（因产物长度很小，需要
3%
以上
的琼脂糖胶）
。
2
、
miRNA
反转录
< br>miRNA
的反转录与一般基因的反转录过程基本相同。因为其产物很短，用最普
通的逆转录酶
即可。我们一般使用的是
TIANGEN
的
MLV
，逆转录体系为：
RNA 500ng~2ug
5xbuffer 2ul
dNTP
0.25ul
DDT 0.25ul
RRI 0.25ul
MLV
0.25ul
RT primer 0.5ul
H2O(RNase free)
补至
10ul
程序为
（
PCR
仪中通常命名为
CT
FRT
）
16
度，
30min
；
42
度，
60min
；
85
度，<
/p>
5min
；
4
度
，
hold
。
！
！做
miRNA
的反转录时，注意
不要忘记内参的
RT
，即一个样品至少要做目的
miRNA
和内参
两管反转录反应。
< br>
3
、
realtime-PCR
实验
miRNA
逆转录完成后得到的
cDNA<
/p>
即可进行下一步
PCR
。
在确认引物的特异性后，
我们可以进
行正式实验。
一般每个样品至少需要
3
个平行孔。
Realtime
PCR
体系为
（
ABI
定量
PCR
仪
需
要加
ROX dye
II
，
Biorad
定量
PCR
仪不需要加
ROX
）
：
2X SYBR 10 ul
ROX II
0.4ul
（
Biorad
不加）
Primer
1ul
Template 1ul
H2O 7.6ul
（
Biorad
8ul
）
需要注意的几点：
1
）在配制
PCR
体系
时，请一定配制总体系，逐步分装。每步分装前充分
混匀。这一点是
PCR
平行性的保证。
2
）配制体
系尽量在冰上进行。
3
）请选用比较准确的枪
< br>进行体系配制，并注意体系的冗余。一般来说，配制一整个
96
< br>孔板的
PCR
体系，我会配制
1
00
个反应的总量，保证分装到最后稍有剩余。
PCR
程序：
95
度，
1min
；
95
度，
5s
；
60
度，
34s
（此步在
读取荧光值）
。
40
到
45
个循环。
4
、
realtime
PCR
结果分析
realtime
PCR
反应结束后返回
Ct
值，可以利用定量
PCR
仪软件自带的程序进行分
析，也可
以利用
EXCEL
表格进行相
对定量计算。具体的计算方法：将三个平行孔的数值拷入到
EXCEL
< br>表格的相应位置，即可自动计算出相对值。注意，第一组样品的值将被默认为归一为
1
。其
他的样品与之相比得出相对值。
EXCEL
表格公式见附件。
二、
miRNA
靶基因的预测
miRNA
靶基因预测软件简介
1
、
TargetScan
：
/
首先选择预测的物种，
如果要预测小鼠的
miRNA
和靶基因，则点击右上角的“
Go to
TargetScanMouse
”
。
第二个选项可输入基因名
（有
时不识别别名）
，
点击
submit<
/p>
即可，此操
作可预测可能靶向该靶基因的
miRNA
；
或者输入
miRNA
的名字，
点击
submit
，
此操作可以预
测该
miRN
A
的靶基因。
2
、
Pic
tar
：
/
输入网址后进入
pictar
主页，<
/p>
下面有几个可选用的数据库，
一般选用最后两个数据库即可。
点击进入预测界面。选择物种，选择要预测的
miRNA(
注意：如果你感兴趣的
miRNA
在下拉
菜单中未列出，则不可预测，可考虑换用其他软件
)
< br>并点击
search
for
targets
of
a
miRNA
或输入
gene ID
（注意：与
targetscan
不同，<
/p>
pictar
一般不识别基因名，最好输入
gene
号：
NM_*****
）点
击
search for all miRNAs predicted to
target a gene.
进行预测。
3
、
Mirbase
：
/enright-
srv/microcosm/cgi-bin/targets/v5/
分别输入
miRNA
名或基因名即可进行预测。
其他选项不用更改。
预测结果的处理和分析
我们通常会将三种不同软件的分析结果做比较，
选取两种以上软件预测的交
集部分作为我们
候选的靶基因。如果这样的结果仍然过多，可以选取三种软件预测的交集
进行下一步筛选。
如果三种软件预测的结果没有交集部分，可以取并集，然后从中按功能
提示进行挑选。
三、
miRNA
的过表达和敲低
1
、
过表达
过表达
miRNA
一般可采用两种方法：
a
构建过表达载体；
b
人工合成成熟<
/p>
miRNA
。
a
构建过表达载体
1
）
获取
miRNA
基因的序列及旁侧序列
进入
< br>Ensembl(
/
)
主页。<
/p>
输入
miR
NA
名，点击进入。在
export
data
页面上选择输入
5’flanking
sequence
和
3’flanking
sequence 分别为
200bp(
见下图
)
，然后点击
next
即可得到包括前体和左右侧
翼
200bp
的序列。
2
）<
/p>
基于这段序列，
我们可以设计该
miRN
A
的表达序列。
引物设计原则：
扩增产
物包括前体，
并左右各有至少
70bp
的侧翼序列，长度一般在
200bp-500bp
。其他同一般
引物设计。载体
可以选用任意使用
RNA
polII
识别的启动子的载体，
包括
T7
，
CMV
等。
常用的是
pcDNA3.1
，
不要带标签的。
注意：如果
miRNA
位于
cluster
中，则扩增长度要控制，避免同时包括两个
或两个以上的
miRNA
。完成表达载
体的克隆并测序确认后，转入到细胞中进行表达检测。如
果目的
miRNA
的表达明确，则载体构建完成。