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转录组测序问题集锦
转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合,转录组测序
(RNA-
seq)
是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录分析的方法
,
可以对全
转录组进行系统的研究。
Roche GS FLX Titanium
、
Illumina Solexa GA
IIx
和
AB SOLID
4
均可以对转录
组进行测序,
Roche GS FLX
Titanium
与
Illumina Solexa GA
IIx
和
AB SOLID 4
相比,
拥有更长的读长和较小的数据量,适用于表达量较高基因的
RNA
全长测
序。
但是对低表达丰度的基因,
可能需要多次测序才能得到足够的数据,
成本比
较高
,而
Illumina Solexa GA
IIx
和
AB SOLID 4
数据读
取量大,能够得到较高
的覆盖率,
可以较好的降低成本。
若是位置基因组序列的物种,
则
Roche
GS FLX
Titanium
测序更有优势,其较长的读长
便于拼接,获得更好的转录本数据。
转录组测序可以供研究者
在转录本结构研究
(基因边界鉴定、
可变剪切研究等)
,
转录本变异研究(如基因融合、编码区
p>
SNP
研究),非编码区域功能研究
(
p>
Non-coding RNA
研究、
mi
RNA
前体研究等),基因表达水平研究以及全新转
录本发现等
方面进行深入研究。
研究转录组的方法有哪些?
答:
p>
目前研究转录组的方法主要三种,
基于杂交技术的
< br>cDNA
芯片和寡聚核苷酸
芯片,
基于
sanger
测序法的
SAGE
(serial analysis of gene expression)
、
p>
LongSAGE
和
MPSS(massi
vely parallel signature sequencing)
,基于第
二代测序技术的转录
组测序,又称为
RNA-
Seq
。
转录组测序比其他研究方法有哪些优势
?
答:转录组测序具有以下优势:(
1
)可以直接测定每个转
录本片段序列、单核
苷酸分辨率的准确度,
同时不存在传统微阵
列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反
应和背景噪音问题;(
2<
/p>
)灵敏度高,可以检测细胞中少至几个拷贝的稀有转录
本;(
p>
3
)可以对任意物种进行全基因组分析,无需预先设计特异性探针,
因此
无需了解物种基因信息,
能够直接对任何物种进行转录组分
析,
同时能够检测未
知基因,
发现新的
转录本,
并准确地识别可变剪切位点及
cSNP
,
UTR
区域。
(
4
)
检测范围广,
高于<
/p>
6
个数量级的动态检测范围,
能够同时鉴
定和定量稀有转录本
和正常转录本。
转录组测序有什么样的样品要求?
答:(
1
)
样品纯度要求:
OD
值应在
1.8
至
2.2
之间;电泳检测
28S:18S
至少
大于
1.8
。
(
2
)样品浓度:
total RNA
浓度不低于
400
ng/μg
。
(
3
)
total RNA
样品请置
于
-20
℃保存;请提供
total
RNA
样品具体浓度、体积、
制备时间、溶剂名称及物种来源。
请同时附上
QC
数据,包括电泳胶图、分光光
< br>度或
Nanodrop
仪器检测数据。
< br>
(
4
)样品请置于
1.5 ml
管中,管上注明样品名称、浓度以及制备时间,管口使
用
Parafilm
封口。
< br>建议使用干冰运输,
并且尽量选用较快的邮递方式,
以降
低运
输过程中样品降解的可能性。
mRNA
的纯化分离方法?
答:进行
mRNA
研究中,首先需要对样本进行
总
RNA
抽提,抽提得到的
RNA
p>
除
含有
mRNA
外
,
还含有
rRNA
和
< br>tRNA
,
为防止这两类
RNA
对转录组研究的影响,
因此我们需要对
mRNA
进行分离纯化。真核细胞的
mRNA
< br>分子最显著的结构特
征是具有
5’
端帽子结构(
m7G
)和
3’
端的
Poly(A)
尾巴。绝大多数哺乳类动
物细
胞
mRNA
的
3’
端存在
20-30
个腺苷酸组
成的
Poly
(
A
)尾,通常用
Poly
(
A+
p>
)
表示。
这种结构为真核
< br>mRNA
的提取,
提供了极为方便的选择性标志,
寡聚
(
dT
)
纤维素或寡聚
(
U
)
琼脂糖亲合层析分离纯化
mRNA
的理
论基础就在于此。
mRNA
的分离方
法较多,其中以寡聚(
dT
)
-
纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方
法。此法利用
mRNA 3’
末端含有
Poly
(
A+
)的特点,在
RNA
流经寡聚(
dT
)纤
维素柱时,在高盐缓冲液的作用下,
mRNA
被特异地结合在柱
上,当逐渐降低盐
的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,
m
RNA
被洗脱,经过两次寡聚(
dT
)
纤维柱后,即可得到较高纯度的
mRNA
。
使用
Solexa
进行转录组测序时,
样本
RNA
如何进行片段化处理?
cDNA
插入片
段长度的选择?
答:
Solexa
转录组测序文库构建时采用专用的打断
Buffer
对
RNA
样本进行片
段
化处理,
这种方法充分利用
RNA<
/p>
对二价阳离子的敏感性,
具有稳定性好的优点,
< br>通过这种方法打断能得到更加均匀的覆盖率。
mRNA-
seq
可以既可以采用单端测
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