-
进出口燕窝及其制品中唾液酸的测定方法
编制说明
1
任务来源
本检验方法标准的制定工作是按照国家认证认可监督管理委员会《关于下达
2009
年度
出入境检验检疫行业标准制（修）订计
划的通知》下达的任务而进行的，广东局承担研究制
订检验检疫行业标准《出口燕窝及其
制品中唾液酸的测定方法》任务，计划编号为
2009B488k
。考虑到大部分燕窝及其制品来源于进口，本标准改为为《进出口燕窝及其制品
中唾液
酸的测定方法》
。
2
标准制定的意义
传统意义的燕窝是指
金丝燕在人烟罕见的海岛悬崖峭壁上喂养育雏鸟而筑造的巢窝，
燕
窝是传统名贵滋补食品，主要产于东南亚国家和我国南海诸岛。
据有关统计资料表明，我国目前是世界第一的燕窝销售大国，
2008
年我国的燕窝销售
额达到
100
多亿元。
因为物稀价贵，
特别是监督执法中缺乏有效的检验
鉴别手段，
导致市场
上出现大量假冒伪劣产品，
极大的损害了消费者的利益，
扰乱了市场经济秩序。
为
了从根本
上解决燕窝及其制品的真假鉴定难题，
确定燕窝及其制
品中唾液酸的含量等一系列问题，
建
立燕窝的定性、定量检测方
法是当前工作中的迫切需要。
3
编制规则
本标准遵循
GB/T
1.1-2000
《标准化工作导则
第
1
部分：标准
的结构和编写规则》和
GB/T
20001.4-2001
《标准编写规则
< br>第
4
部分：化学分析方法》的编写规则。
4
标准编制依据和主要内容
本标准主要
参考广东出入境检验检疫局的非标《燕窝及其制品中唾液酸含量的测定方
法》
。本行标主要制定了燕窝及其制品的样品前处理方法，试样中唾液酸的测定方法，包括
二种测定方法：分光光度法与液相色谱
-
质谱
/
质谱法，后者还可以对燕窝真假进行确证工
作
。
5
燕窝基本信息
5.1
燕窝的常见品种简介
a.
以燕窝的形状区分为：燕盏，燕
块（饼）
，燕条，燕丝，燕碎和燕球等；
b.
以燕窝的颜色分为：白燕（又称
官燕）
，黄燕，血燕三类；
c.
以筑巢的习性分为：屋燕、
洞燕、毛
燕、草燕四类。金丝燕筑巢在山洞里形成的燕窝，
俗称“洞燕”
，金丝燕筑巢在人工搭建的屋子里形成的燕窝，俗称“屋燕”
。
5.2
燕窝制品的种类简介
冰糖燕窝
(
饮品
)
、冰糖银耳燕窝、冰糖雪蛤燕窝
、冰糖虫草燕窝、虫草燕窝
、冰糖人
参燕窝即食燕窝、胶原蛋白无糖燕窝饮品、浓缩燕窝
(
饮品
)
、燕窝提取物和燕窝液等。
5.3
唾液酸的简介
燕窝主要成分包括酸性蛋白等，
其特征物质是唾液酸糖蛋白。
唾液酸糖蛋白可以在一定
的酸性
条件下水解出游离的
N-
乙酰神经氨酸单体，又名唾液酸。唾液酸
(sialic
acid)
是一
类神经氨酸的衍生物，
广泛存在于多种生物组织中，
是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重
要成
分。在大部分哺乳动物组织中发现的唾液酸主要是
N-
乙酰神经氨酸。唾液酸又称燕窝酸，
原因是其在燕窝中含量最高，是
燕窝的主要活性成分
,
是智力发展催化剂。
表
1
唾液酸的信息
CAS
编码
英文通用名称
中文通用名称
英文化学名称
中文化学名称
131-48-6
Sialic acid
唾液酸
5-Acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-
galactononulosonic acid
5-
乙酰氨基
-3, 5-
二脱氧
-D-
甘油
-D-
半乳壬酮糖
分子式
C
1
1
H
19
NO
9
结构式
理化性质
分子量
309.27
纯唾液酸是无色的
,
易溶于水
,
在水溶液中不发生变旋作用。纯的聚唾液<
/p>
酸是白色不定型高聚合物
,
在酸的作用下
容易降解成单体的唾液酸。
聚唾
性状描述
液酸水溶性优良
,
低黏度
,
生物相容性好
,
具有
生物可降解性。纯的
N
-
乙
酰神经氨酸和
N
-
羟乙酰
神经氨酸在水溶液中很稳定
, 4
℃时贮藏数月不
发生变化。
如果溶液中含有非常微量的有机酸
,
其稳定性就受到很大的影
响。二乙酰和三乙酰神经氨酸不稳定
,
在常温下易变成
N-
乙酰神经氨酸。
唾液酸是一族神
经氨酸的衍生物
,
广泛存在于多种生物组织中
< br>,
是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的
作用
< br>
重要成分
,
同时也是一种天然
的大脑营养素
,
它能增强婴儿的记忆力和促进智力的发育。
< br>N-
乙酰神经氨酸
(
唾液酸的一
种
)
对病毒从感染的宿主细胞中释放新复制的病毒颗粒具有重要
的
作用。通过抑制
N-
乙酰神经氨酸可
以干扰和阻止病毒的复制
,
达到治疗流感的目的。
6
检测方法与技术论证
6.1
唾液酸标准曲线的制作
标准曲线：称取唾液酸标准品
2mg
，溶解定
容到
10mL
，浓度为
200
?
g/mL
，再逐级稀释到
100
?
g/mL
、
50
?
g/mL
、
20
?
g/mL
、
10
?
g/mL
、
5
?
g/mL
。分别取
2mL
，加入茚三酮指示剂（往
2.5
g
茚三酮中加入
60 mL
冰醋酸和
40mL
盐酸，搅拌溶解）<
/p>
2mL
与冰醋酸
2mL
< br>，摇匀，在
100
℃水浴
中显色
10min
，
取出试管在流动水中迅速
冷却，
然后倒入
1cm
比色皿中，<
/p>
在
470nm
波长处测定
吸光度
OD
。得出如下表
2<
/p>
数据结果。
表
2
唾液酸标准溶液对应的吸光度
浓度
（
?<
/p>
g/mL
）
0
5
10
20
50
吸光度
（
470nm
）
0.000
0.0407
0.1264
0.1979
0.4083
100
200
0.8714
1.5857
根据上
述数据制作标准曲线（见图
1
）
，得出
唾液酸标准溶液浓度
x
与吸光度
y
的关系
式：
y = 0.0081*x+0
.026
，相关系数
r=0.9986
，线性关系良好。
唾液酸系列浓度的吸光值
1.8
1.6
1.4
1.2
吸光值
470nm
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
溶液浓度
y =
0.0081x+0.026
2
= 0.9986
R
图
1
唾液酸标准溶液浓度对应的吸光度关系图
6.2
燕窝的前处理过程
根据样品的状态分为
2
种前处理，即固态燕窝和液
态的燕窝制品。
6.2.1
固态燕窝的前处理过程
取有代表性的
燕窝样品（同批燕窝的外观应没有明显差异，色泽、形态、大小等特征基
本一致；如果存
在明显差异，需充分搅碎混合均匀）先经烘干，去除水分，冷却到室温后采
用研钵进行研
磨，
注意剔除样品含有的杂毛杂草等，
然后过
< br>100
目筛，
筛下物即为制备好的
燕窝试样，为避免受潮，需尽快称量进行后续操作。
6.2.2
液态燕窝制品的前处理过程
液态燕窝
制品通常是用玻璃瓶独立包装，
应取整瓶制样打浆均匀，
一般会
产生泡沫，
需
静置一段时间等待分层，除去泡沫。当样液清晰可
见时，取适量装入透析膜中，扎紧两端，
在自流水中透析
24<
/p>
小时。透析的作用是采用透析膜（透析膜规格：允许分子量小于
1
0000
的物质透过，透析膜宽度在
2.5
厘米左右。
）和自流水来除去燕窝制品中的冰糖等物质，因
为冰糖等糖类物质会影响后期的水解、
吸光测定步骤，
冰糖等小
分子物质会穿过透析膜进入
到含糖浓度低的自流水。
其中燕窝的
有效成分因为分子量大于
10000
，
而被保留在透析膜内。
透析结束后，剪开膜袋，内容物装入洁净容器，即可进行后续操作
（必要时冷藏放置）
。
6.3
燕窝酸水解过程的选择及优化
燕窝样
品经过酸水解释放出唾液酸，所以酸水解是影响结果的重要步骤，如何选取合
适的水解条
件是决定唾液酸是否释放完全的关键。
本标准实验重点对水解时间、
水解酸种类
和水解酸浓度进行了单因素实验，以期得到优化的水解条件。
6.3.1
水解试剂的选择
6.3.1.1
水解试剂种类的单因素实验
考虑到试剂的安全与适用性，本试
验选取了三种水解试剂：水、盐酸、醋酸。
样品：采用同一白燕盏样品进行对比试验。
盐酸浓
度：
10%
、
20%
< br>、
30%
。醋酸浓度：
10%<
/p>
、
20%
、
30
%
。水：蒸馏水。
酸水解条件：称样品
0.12 g
，加
酸
20mL
，加沸石，在电热板上加热回流，水解
10
分钟。
不加酸水解：称样品
0.12 g
，加
水
20mL
，加沸石，在电热板上加热回流，水解
10
分钟。
将水解液转移定容到
100ml
容量瓶中，
取部分倒入离心管
（装有
1.2g
硫酸铵）
中，
3000rpm
离心
10min<
/p>
。分别取上清液
2mL
，加入茚三酮指示
剂
2mL
与冰醋酸
2mL
，摇匀，在
100
℃
水浴中
显色
10min
，取出试管在流动水中迅速冷却，然后倒入
1cm
比色皿中，在
470nm
波
长处测定吸光度
OD
。
<
/p>
所得实验数据见下表
3
。
表
3
不同水解试剂的对比结果
水解试剂种类
及浓度
30%
醋酸
30%
盐酸
20%
醋酸
20%
盐酸
10%
醋酸
10%
盐酸
水
称样量
g
0.1202
0.1202
0.1202
0.1202
0.1203
0.1202
0.1202
吸光度
OD
470nm
1.329
0.301
1.317
0.284
1.246
0.352
0.348
2.89
12.59
2.72
11.91
3.37
3.33
唾液酸含量
%
12.71
水解液呈半透明白色
水解液呈酱黑色，并有黑色渣体
水解液呈半透明白色
水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体
水解液呈半透明白色
水解液呈酱黑色，并有少量黑色渣体
水解液呈半透明白色
水解现象观察
结论：盐酸比同浓度的
醋酸水解所得唾液酸含量都低，并且颜色呈黑色，不利于观察与
比色。水的水解结果也低
于
20%
醋酸及
30%
醋酸。说明盐酸和水的水解效果比醋酸差。在本
实验中，醋酸是理想的水解试剂
。
6.3.1.2
水解试剂浓度的单因素实验
在确定了
水解试剂是醋酸后，应对其适宜的水解浓度进行单因素实验。
醋酸浓度：
5%
、
25%
、
50%
、
75%
、
95%
。水解条件：同上
6.3.1.1
。对比结果见下表
4
。
表
4
不同水解酸浓度的对比结果
醋酸浓度
%
5
25
50
75
95
称样量
g
0.1218
0.1219
0.1216
0.1219
0.1218
吸光度
OD
470nm
1.058
1.568
1.500
1.287
1.018
唾液酸含量
%
9.98
14.79
14.18
12.14
9. 61
水解过程泡沫多
水解过程泡沫较多
无特殊现象
无特殊现象
水解液粘稠
现象观察
18
16
14
12
10
< br>8
6
4
2
0
0
25
50
醋酸浓度（%）
75
100
唾
液
酸
含
量
（
%
）
图
2
不同醋酸浓度的对比结果
结论：
25%
和
50%
的
醋酸溶液水解得到的唾液酸含量最高，结果均大于
10%
，相差
不多；
5%
和
95%
< br>的醋酸溶液水解得到的唾液酸含量最小。从水解现象观察来看，
5%
醋酸水解燕窝时
三角瓶中产生丰富泡沫，多时会上冲到冷凝回流管中，会造成
水解液流失。
25%
醋酸水解时
也产生
泡沫。
95%
醋酸水解后产生的燕窝液体呈胶态粘稠，不易全部
溶解于实验用水，定容
时产生损失。综合考虑，
50%
醋酸水解是适宜的。
6.3.2
水解时间的优化
已确定
50%
醋酸是适宜的水解试剂，再试验研究其适宜的水解时长。水解时间：<
/p>
5
、
10
、
15
、
20
、
25
、
30
、
35 min
。水解条件：同上
6.3.1
.1
。对比结果见下表
5
。
表
5
不同水解时间的对比结果
水解时间
min
称样量
g
5
10
15
20
25
30
< br>16
14
吸光度
OD
470nm
1.303
1.428
1.272
1.216
1.107
1.186
唾液酸含量
%
12.35
13.5
12.06
11.51
10.47
11.20
现象观察
0.1213
0.1216
0.1212
0.1214
0.1215
0.1217
水解液呈白色透明
水解液呈白色透明
水解液呈白色透明
水解液呈微黄色
水解液呈黄粉色
水解液呈黄粉色
唾
< br>液
酸
含
量
（
%
）
12
10
8
6
4
2
0
0
5
10<
/p>
15
20
25
3
0
35
水解时间（min）
图
3
不同水解时间对应的唾液酸含量
结论
：随着水解时间的延长，唾液酸含量的变化不明显，唾液酸含量在
10
< br>分钟时出现
了较高值。但是，时间长后得到的水解液颜色逐步变深，不利于比色。
所以，适宜的水解时
长应是
10
分钟。
6.4
公式结果的推导与表述
试样中唾液酸
含量
x
的计算公式：
X
?
c
?
k
…
…
…
…
…
…
…
…
…
（
2
）
m
?
< br>1000
式中：
X
——
试样
中唾液酸含量，单位为克每百克（
g/100g
）
；
c
——
为标准曲线查得的样品唾液酸含量，
μ
g/mL
；
k
——
稀释倍数；
m
——
为试样质量，单位为克，
g
。<
/p>
当结果小于
1%
时计算结果保留二位有效数字。当结果大于
1%
时，计算结果
保留三位
有效数字。
经过测定，真品
燕窝的唾液酸含量在
10
％左右。不同试样燕窝的唾液酸含量范
围如下：