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WB
的转膜和染色
凝胶中蛋白的可视化
在现阶段染胶可
用于确定蛋白的迁移是否均匀一致。
如果您计划将蛋白转印到膜上，
则使用
铜染色法，
因为考马斯染色不可逆。
考马斯染色仅适用于以下情形：
在转膜后染胶检查转膜
效率；不需要转膜，只需观察
SDS-PAGE
结果。
考马斯染色
切断电源后，
分离的蛋白条带就会开始扩散
（溶于水溶液）
。<
/p>
为了防止蛋白的扩散，
用
40%
蒸
馏水、
10%
醋酸、
50%
甲醇的溶液处理凝胶，就会使大多蛋白沉淀（变得不可溶）。
为了让固定的蛋白可视化，在相同比例的水
/
< br>醋酸
/
甲醇混合物中加入质量比
0.25%
的考马
斯亮蓝
R-25
0
，
然后将凝胶放置溶液中，
在振荡器
上室温孵育
4
小时至过夜。
接下来
将凝胶
（保存染料；
可重复多次使用）
转移到
67.5%
蒸馏水、
7.5%
醋酸、
25%
甲醇的混合溶液中，<
/p>
放置在振荡器上，洗去多余的染料。
染料不会结合丙烯酰胺，因此会被洗脱（留下干净的凝胶）。但是，染料会与凝胶中的蛋白
紧密结合，显示为深蓝色。
铜染色法
用蒸馏水简单冲洗经新鲜凝胶
（最多
30
分钟）
，
然后转移至
0.3 M CuCl
2
溶液染色
5
–
15
分
钟。
接下来用去离子水简单清洗凝胶，
在暗视野背景下观察。
蛋白在半透明蓝色背景下形成
清晰条带。凝胶可以用
0.1
–
0.25 M Tris/0.25 M EDTA
pH 8.0
重复冲洗至完全脱色。根据转
膜仪器制造商的说
明，进行转膜。
转膜
转膜流程的详细说明可在转膜仪
器制造商的网站上找到，
根据系统的不同而有所区别。
但是，<
/p>
每种方法的原理都一样。
带电荷的蛋白
（
SDS
提供）在电场中可以在凝胶中移动，从凝胶转
移到膜上，
显示蛋白的
“
印迹
”
。
早期的方法依赖于扩散；<
/p>
现在在电场中进行印迹是标准方法
了。
转膜可以湿转或半干转。
湿转由于膜的干燥而更不容易失败，<
/p>
尤其推荐用于大蛋白转膜。
在
两种转膜方
法中，
膜都放置在凝胶旁边，
两者夹在滤纸中间，
整个三明治结构夹在固体载体
之间，保持凝胶与膜之间的紧密接触。
在湿转中，
凝胶和膜紧紧地夹在海绵和滤纸之
间
（海绵
>
滤纸
>
凝胶
>
膜
>
滤纸
>
海绵）
，
确保凝胶与膜之间不形成气泡。
三明治结构浸泡在转
膜缓冲液中，
对其施加电场。
负电荷蛋
白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。
湿转的标准缓冲液与跑胶缓冲液所用的都是
1x
Tris-
甘氨酸缓冲液，但是没有
SDS
，并加入
了甲醇至终浓度
20%
。对于分子量大于
100 kDa
< br>的蛋白，推荐在转膜缓冲液中加入终浓度
为
0.1%
的
SDS
。
在半干法转膜中，三明治由滤纸
>
凝胶
>
膜
>
滤纸组成，在转膜缓冲液中浸湿，直接放置
在正负电极之间
。在转膜中，膜靠近正极、凝胶靠近负极，这很重要。
半干转的转膜缓冲液中
Tris
和
甘氨酸的比例不一定与湿转一致，
请参考仪器制造商的实验方
案
。标准配方是
48 mM
Tris
、
39 mM
甘氨酸、
0.04%
SDS
、
20%
甲醇。
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?
?
?
有两种类型的膜：硝酸纤维素膜（
NC
膜）和
PVDF
膜，实验效果都很不错。
PVDF
< br>膜要求
进行预处理：将膜裁剪为合适的大小，然后在甲醇中浸泡
< br> 1
–
2
分钟。之后转移膜至
冰冷的
转膜缓冲液中孵育
5
分钟。
未能在转膜缓冲液中平衡的膜会导致转印时皱缩、条带错位。
小分子和大分子蛋白的转膜
转膜缓冲液中
SDS
和甲醇的平衡
、蛋白的大小、胶的浓度会影响转膜效率。如下调整可以
增加转膜效率：
大分子蛋白
(>100 kD)
对于大分子蛋白，
其在凝胶电泳时分离迁移较慢，
从凝
胶中转膜也很慢。
因此跑胶时应该使
用低浓度的凝胶，
8%
或更低。由于低浓度的胶易碎，所以操作时需十分小心。
大分子蛋白易在凝胶里形成沉淀聚集，
阻碍转膜。
在转膜缓冲液加入终浓度
0.1%
的
SDS
，可以避免出现这种情况。由
于甲醇易使
SDS
从蛋白上脱落，因此降低甲醇的浓度至
10%
或更低，可以防止蛋白沉淀。
降低转膜缓冲液中甲醇的比例也会促使凝胶的肿胀，让大分子蛋白更容易转膜。
只有使用
NC
膜时才必需使
用甲醇。如果是
PVDF
膜，在甲醇
激活膜后，转膜缓冲
液中可以不加入甲醇。
选择湿转
4°
C
过夜，不建议选择半干转。
小分子蛋白
(<100 kD)
SDS
妨碍蛋白与膜的结合，对于
小分子蛋白更是如此。因此小分子蛋白的转膜，转膜缓冲
液中可以不加
< br>
SDS
。
保持甲醇的浓度
< br>20%
。
对于
500 kD
的蛋白，请参考下列文献的凝胶和缓冲液系统：
Bolt MW and Mahoney PA (1997).High-
efficiency blotting of proteins of diverse
sizes following sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis.
Anal
Biochem
, 247,
185
–
92.
更多转膜提示：
使用镊子，避免手指
接触膜。手指上的油和蛋白会阻碍转膜，形成脏的印迹。
将凝
胶和膜夹在滤纸中间后，
两者之间的气泡可以通过滚筒、
移液管
或者
15 mL
管
滚压三明治结构来去除，或者在装有转膜缓冲液的盘中组装三明治结构，防止气泡形成。
确保将滤纸和膜的大小剪裁得与凝胶一致。在半干
转中，较大的突出会阻止电流通
过膜。
鸡来源的抗体会结合在
PVDF
膜上，形成高背景。改用
NC
膜可以帮助降
低背景染
色。
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丽春红染色使膜上蛋白可视化
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