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多肽组技术与应用
魏开华
北京蛋白质组研究中心
主要内容
1.
背景介绍
2.
多肽组样品制备
3.
非原位多肽组研究
4.
原位多肽组研究
5.
应用示例
多肽组
（
peptidome
）
是指活体
生物器官、组织、细胞和体液中的全部内源性多肽组份。多
肽组学就是研究多肽组的结构
、
功能、
变化规律及其相关关系的学科。
多肽组学和蛋白质组
学都是基因组学的补充，
多肽组学填补了
蛋白质组学与代谢组学
(metabonomics)
之间的<
/p>
“
间隙
（
gap
）
”
。标准的蛋白质组研究策略不适合
多肽组研究，因为它们不能覆盖到较小的分子量
区域。
Peptidomics
多肽组的生物来源：
1.
动物体液：血、乳汁、脑脊液、
胃液、尿液、精液、唾液、毒囊（如蜂毒、蝎毒、
蜘蛛毒）等
2.
动物组织：肝、脾、肾、血管、
肠、海马、表皮、睾丸、卵巢、子宫、眼球等
3.
某些植物：花粉、果汁、海藻等
血清
包含蛋白质和小分子多肽、盐、类脂、氨基酸和糖等，数量达百万种，其中水
90%
～
91%,
蛋白质
6.5%
～
8.5%
和多肽
2%
左右。
多肽组研究
1.
多肽组样品制备
2.
非原位多肽组研究（血清多肽组）
3.
原位多肽组研究（质谱成像）
血清处理的结果范例：
SDS-
PAGE
血清处理的结果范例
-MS
ZipTip
是一种末端带有约
0.6
μ
L
层析介
质的
10
μ
L
吸管尖，因此不会出现死体积。它是质
谱分析之前快速（数秒种）浓缩、脱盐和分馏多肽
、蛋白质或寡核苷酸的好工具。
这
种装置结构简单，使用方便。使用时，将其置于一个单管或多管的移液器、标准的
22<
/p>
格
钝端的
HPLC
针、或自动的液体操作
/
样品制备的工作站上。为了吸附样品
，通过介质反复
抽、吸几次。此时，污染物也以同样的方式被清洗掉。然后将浓缩、纯化
后的样品用
1-4
μ
L
相容的溶剂精确地洗脱，
直接转移到质谱仪或小瓶中。
对于那些要求较小洗脱量的应用
（例
如小于
1
μ
L
）
，可用仅含
0.2
μ
L
介质的微量规格。
特
点
1.
可纯
化及浓缩
fmole~pmole
的生物样本。样本需要少。<
/p>
2.
可以避
免清去污剂和其他缓冲盐等对质谱分析的准确性及重現性的影响
3.
分离填料置于微量吸管
(pipette
tip)
內操作方便
常用树脂种类及其应用
C18
去除
peptide
，
protein
或
oligonu
cleotides
样本内的盐类及浓缩样品，
增加
MALDI-TOF MS
的灵敏度及解析度
C4
蛋白质去盐及浓缩
SCX
去除样品中的清洁剂，浓缩含有机溶液的多肽
常用种类及规格
ZipTip
脱盐通用步骤
（
1
）用
50%ACN
中性溶液活化
Millipore C18 ZipTip.
吸排
5~10
次。
（
2
）用
0.1%
甲酸溶液平衡
C18 ZipTip
。吸排除
5~10
次。
（
3
）用
2
ul 0.1%
甲酸溶解酶切产物，用
C18 ZipTip
吸附肽段。吸排
5~10
次。
（
4
）用
0.1%
甲酸溶液洗盐。吸排除
2~3
次。
（
5
）用
4
ul
含
0.1%
甲酸的
50%ACN
溶液洗脱肽段供质谱分析。
2 ul
/
次，吸排
2
次。
金属亲和
ZipTip
磷肽处理
步骤
不要有高浓度有机溶剂
金属亲和
ZipTip
磷肽处理步骤（
1
）
0.1% acetic acid or 0.01% formic acid
with 10% acetonitrile
金属亲和<
/p>
ZipTip
磷肽处理步骤（
2
）
金属亲和
ZipTip
磷肽处理步骤（
3
）
效果比较
多肽组研究的主要方向
1.
非原位多肽组研究（血清多肽组）
2.
原位多肽组研究（质谱成像）
典型的多肽组技术：非原位
MALDI-TOF-MS
，
LC-
ESI-MS, Q-FT-MS
分析
ESI-CID,
MALDI-
TOF/TOF, MSn
测序
生物信息学软件分析、建模，早期诊断
多肽制备的核心问题一：重复性
<
/p>
同一例样品连续
3
天检测的重复性比较<
/p>
方法可靠性研究
Normalized Peak Intensity
Comparison
样本保存时间的比较
(-80
℃
)
洗脱液的优化
FT-
MS
和
MALDI-TOF-
MS
对样品处理要求差异很大
点靶条件的优化
样品和基质的比例<
/p>
不同样品处理方法的比较
不同人员处理的比较
稀释效应
提问与解答：
蛋白组样品制备为什么不建议在后期进行浓缩和稀释？
沉淀、溶解度、高级结构、离子强
度、
pH
、动态范围、低丰度蛋白。等电聚焦。
多肽组可以进行适当的浓缩和稀释？
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BioMarker
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