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基于
CRISPR-
Cas9
系统的基因组编辑技术
[<
/p>
摘要
]
Clustered
regularly interspaced short palindromic repeats
(
CRISPR
)
系
统
成
功
被
改<
/p>
造
为
第
三
代
人
工
核
酸
内
切
酶
,
与
锌
指
核
酸
内
切
酶
(zinc
finger
end
onuclease
,
ZFN)
和类转
录激活因子效应物核酸酶
(transcription
activator-like
effector
nuclease
,
TALEN)
一样可用于各种复杂基因组的编辑。该系统在
crRNA
的指导下,使核酸酶
Cas
识别并降解外源
DNA
,其中,Ⅱ型
CRISPR-Cas
系统
最为简单,仅包括一个核酸酶
Cas9
与
tracrRNA
:
crRNA
二聚体便可完成其生物
功能。基于
CRISPR-Cas9
的基因编辑技术的核心为将
tracrRNA
:
crRNA
p>
设计
为引导
RNA
,
在引导
RNA
的指导下
Cas9
定位于特定的
DNA
序列上,
进行
DNA
双链的切割,<
/p>
实现基因组的定向编辑。
目前该技术成功应用于人类细胞、
斑马鱼
和小鼠以及细菌的基因组精确修饰,修饰类型包括基因定点
p>
InDel
突变、基因定
点敲入、
两位点同时突变和小片段的缺失.
由于其突变效率高、
< br>制作简单及成本
低的特点,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子
工具。
[
关键词
]: CRISPR-
Cas9
系统;基因组编辑技术;核酸内切酶
简介
近年
来,
基因组编辑技术
(genome engineering
technologies)
的快速发展为生物
学研究带来了新
纪元。
与传统的基因克隆技术不同,
基因组编辑技术可直接在基
因组上进行DNA序列的敲除、
插入、
定点突变以及组合编辑等,
实现基因功能
与调控元件的系统研究
,
在工业生物工程等方面具有广阔的应用前景。
早期,
基
因组编辑技术主要利用同源重组介导的打靶技术,但由于效率较低
p>
(10
-6
~1
0
-9
)
,
极
大地限制了其应用。
为解决这一难题,
一系列人工核酸内切酶介
导的基因组编
辑技术被开发,可通过在基因组特定位置上形成
D
NA
双链断裂(
DNA
double
strand
break
,
DSB)
,
借
助
于
细
胞
自
身
的
修
复
系
统
如
非
同
源
末
端
连
接
(
non-homologous
end
joining,
NHRJ
)或同源重组(
homology
directed
repair
,<
/p>
HDR
)
,从而实现在不同生物与细胞类
型中有效的定点基因组编辑。目前,已有
4种不同的人工核酸内切酶应用于基因组编辑<
/p>
:
巨核酶技术
(Meganucleas
es)
、
锌指
核酸内切酶
(zinc
finger
endonuclease
,
ZFN)
、类转录激活因子效应物核酸酶
(
transcripti
on
activator-like
effector <
/p>
nuclease
,
ZFN
)与
RNA
靶向
DNA
p>
内切酶
Cas9
。
[1]
CRISPR
研究历史
1987
年,日本课题组在
K12
大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间
隔重复序列
< br>[2]
,随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的
基因组中,
2002
年,科学家将其正式命名为
clustered regularly interspaced short
palindromic
repeats(CRISPR)[
3-5]
.因为缺乏病毒和质粒的序列信息,初期对
CRISPR
的研究进展缓慢,其行使的确切功能一直未能阐明.
2005
年,三个研
究小组均发现
CRISPR
的间隔序列
(spac
er)
与宿主菌的染色体外的遗传物质高
度同源,
推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关。
2006 <
/p>
年,
美国研究小组通过生物信息分析预测,
CRISPR
系统可能以类似于真核生物的
RNAi
方式行使其免疫功能
[6]
.但这些都只是假设.
2007
年,
Barrangou
等
[7]
首次发现并证明细菌可能利用
CRSPR
系统对抵抗噬菌体入侵.
2008
年
,
Marraffini
等
[8]
p>
又发现细菌
CRISPR
系统能阻止外源质粒的转移,
首次利用实验
验证了<
/p>
CRISPR
系统的功能,由此科学家们揭开了研究
CRISPR
系统作用机制
的序幕。
之后研究人员很快发现
CRISPR
系统在食品发酵工业和医学中的潜在
价值,使其成为研究的热点。
[9]
CRISPR-
Cas9
系统的作用机制
Crisp
r/cas
系统是很多细菌和古生菌的一种获得性免疫系统,在已经完成测
序的细菌中占
40%
古生菌中占
90%
,它通过
CRISPR
对入
侵的外源核酸分子或
者病毒进行特异性地识别并用
CAS
蛋白对其切割消化,
从而达到
对自身的免疫
性保护。
CRISPR
是
一段特殊的
DNA
重复序列,长度通常为
21~47
个碱基,
可变的间隔序列为
26~72
个碱基。
Cas
存在于
CRISPR
位点附近,是一种双链
DNA
核酸酶。它与
folk
酶功能类似,但是它并不需要形成二聚体就能发挥作
用。在细菌和古生菌中
Crispr/cas
系统主要分为三种类型,根据核心元件和
序列
的不同又分为约
10
种亚型。
菌体通过摄取,
表达以及干涉三个基本
过程发挥免
疫过程。
简单地说就是病毒或核酸分子入侵细菌,<
/p>
细菌将其编辑插入到自身的基
因组
CRISPR
位点附近,在转录表达阶段,
CRISPR
间隔重复序列被转录成不
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