-
一株新饲用乳杆菌的分离鉴定及益生性研
究<
/p>
孙晓雯
1
，刘
庆
2
,
闫轶洁
1
，王安如
1
，汪攀
< br>1
(1.
北京大北农集团
生物饲料工程国家重点实验室，北京
100193
；
2.
中国农业大学
农业生物技术国家重
点实验室，北京
100193)
摘要：
从猪粪便中分离得到一株新饲用乳杆菌
，对其
16S
rDNA
基因进行了测
序，该段基因序列已提交
在
NCBI/Genebank
数据库中，登录号为
HQ641209
。将该
菌株
16S rDNA
基因序列进行在线的
BLAST
比对并
与其他乳杆菌属菌株的
< br>16S
rDNA
序列建立系统发育树，结果显示该菌<
/p>
16S
rDNA
序列与
NCBI
公布的约氏乳
杆
菌<
/p>
Lactobacillus
johnsonii
(
AB295648)
的
同
源
性
为
99.7%
，
因
此
该
菌
鉴
定
为
约
氏
乳
杆
菌
（
Lactobacillus
johnso
nii
）
，
将其命名为
“
Lactobacillus
johnsonii
Sun001
”
。
经测试，
该菌株对
K88
、
K99
菌株的生长
有抑制作用，在
pH2.5
的模拟胃液中处理
< br>3
小时存活率为
68.8%
，在
0.3%
胆盐浓度的
模拟肠液中处理<
/p>
3
小时存活率为
21.4%
。
关键词：
约氏乳杆菌；
益生性；分离鉴定
Isolation and
Identification and Probiotic Characteristics
Study of A New Feeding
Lactobacillus
Sun
Xiaowen
, Liu Qing
, Yan
Yijie
, Wang Anru
, Wang Pan
1
2
1
2
1
(
Key
Laboratory
of
Biological
Feed
Engineering,
DE
BEI
NONG
GROUP,
Beijing
100193
；
Key Laboratories of Agrobiotechnology,
China Agircultural University, Beijing 100193,)
Abstract
:
A new
Lactobacillus was isolated from a faecal sample of
pig. The 16S rDNA gene
was
sequenced,
and
it
was
submitted
to
NCBI/GenBank,
the
accession
number
is
BLAST
with
other
Lactobacillus
and
phylogenetic
analysis
based
on
the
fragment
of
16S
rDNA
reveal
that
its sequence homology was 99.7%
comparing with
Lactobacillus
johnsonii
strain (AB295648). The
isolated strain was identified as
Lactobacillus johnsonii and named Lactobacillus
johnsonii
Sun001.
L. johnsonii
has high level
tolerance to the simulated gastric juice (pH2.5,
3h of
incubation, survival rate is
68.8%) and simulated gastric juice (bile salt
concentration 3%, 3h
of incubation,
survival rate is 21.4%) and high antibacterial
activity to
E. coli
K88,
K99.
Key Words
:
Lactobacillus johnsonii
,
probiotic, isolation and identificaton
饲用微生物添加剂作为一种新型无公害饲料资源已被广泛应用，目前我国农业部
公布了
18
种可直
接使
用的微生物饲料添加剂菌种，
而美国已经公布了
45
种，
欧盟公布了
72
种。
约氏乳杆菌
是欧盟新被批准使用，
在我
国和美国尚待批准使用的饲用微生物菌种。
该菌在防治家禽坏死
性肠炎（
Geier
MS
et
al.,2010
）
、降低腹泻率以及维持猪免疫因子水平方面有很好效果（倪
学勤等，
2008
）
。
因此分离选育具有益生功能的约氏乳杆菌，对于开发新饲用微生物添加剂
产品，增加我国
饲用微生物种类、提高畜禽养殖的生产性能具有重要意义。
1
材料与方法
1.1
材料
分离菌种的猪粪样品采集自北京平谷某猪场；营养肉汤、
MRS
培养基购自北京
奥博星生物技术有限责任公司；大肠杆菌
K88
（
C83901
）
、
K99
（
C83709
）购自中国兽医药品
检查所；胰蛋白酶、胃蛋白酶购自
< br>Sigma
公司；
PCR
试剂购
自生工生物工程（上海）有限公
司。
PBS
缓冲液：
NaCl
8.0g
，
KCl 0.2g
，
Na
2
HPO
4
·
12H
2
O 3
.48g
，
KH
2
PO
4
0.2g
，加蒸馏水至<
/p>
1000mL
，分别调
pH
值至
2.5
、
6.8
、
8.0
，
121<
/p>
℃高压灭菌
20min
。
1.2
猪粪样品中细菌的分离
称取新
鲜样品
（猪粪、鸡粪等）
10g
，置于
90ml
含玻璃珠的
无菌水中，震荡<
/p>
10min
，静置
30s
后即得样品原液。对原液进行
10
倍梯度稀释。取
9
个已
加入
MRS
琼脂的平皿，选取
3
个适当稀释度的稀
释液，分别吸取
100
μ
l
接入平皿，每个稀
释度
3
个重复，用无菌涂布器涂匀
37
℃倒置培养
24
小时。挑取单个菌落革兰氏染色镜检，
对革兰氏阳性、
杆状的细菌平板划线分离三次，取单菌落保存。
1.3
产酸能力鉴定：
将
MRS
平皿上长出的乳白色圆形半透明小菌落点接到溴钾酚紫
BCP
培养基，鉴定产酸能力。
（溴钾酚紫遇酸变黄
，菌落周围黄色区域大小代表菌株产酸能力的
强弱。
）
1.4
乳杆菌的筛选鉴定
：
1.4.1
触媒试验：
挑取固体培养基上
产酸能力强的菌落一接种环，
置于洁净试管中，
滴
加
3%
过氧化氢溶液
2mL
，观察结果。于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。
1.4.2
PCR
法鉴定杆菌
利用乳杆菌属特异性引物：
5
’
< br>-ctc
aaa
act
aaa
caa
agt
ttc-3
’
和
5
’
-ctt gta cac acc gcc cgt ca-3<
/p>
’对筛选到的菌株进行
PCR
鉴定。按细
菌
DNA
提取
试剂盒操作说明书提取模
板
DNA
。
反应体系
< br>20
μ
L
：
10
×
PCR
缓冲液
2
μ
L
、
< br>引物
（
20
μ
mol/L
）
各
0.5
μ
L
、
dNTP
（
2.5mmol/L
）
< br>2
μ
L
、
Taq
酶（
5U/
μ
L
）
0.2
μ
L
、模板
DNA 1
μ
L
、水补足
至
20
μ
L
。反应条件：
95
℃预变性
5min
，
95
℃变性
30s
，<
/p>
55
℃退火
30s
，
72
℃延伸
30s
，进
行
30
个循环，
72
℃延伸
5min
。
2%
琼脂糖凝胶电泳检测，乳杆菌
PC
R
扩增产物为
250bp
（参
考《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》
SN/T
1941.3-2007
）
。
PCR
过程中以短小乳杆菌
（
CGM
CC*****
）
DNA
为模板做正对
照，无菌水为模板做负对照。
1.4.3
16S
rDNA
的
< br>序
列
比
对
及
系
统
发
育
树
的
构
建
利
用
细
菌
16S
通
用
引
物
5
’
-gagagttt
gatcctggctcag-3
’和
5
’
-cggctaccttgttacgactt--
3
’扩增细菌
16S
rDNA
片
段，反应体系、反应条件同
1.3.2
。测序工作在英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，通过
在线
（
/blast
）
与
DDBJ/EMBL/GenBank
中的已知序列进行
Blast
（
Basic
Local Alignment Search Tool
）
比对，使用
MEGA4
软件进行系统发育树的构建。
1.5
抑菌试验
将三角中的营养肉汤
琼脂（含
1%
葡萄糖）融化，
冷却至<
/p>
45
℃。
加入过夜
培养的
K88
、
K99
（每毫升培养基加
入
1
微升菌液）
，震荡混匀。倒入无菌
平板，水
平凝固待用。待充分凝固后，在每个琼脂平板上轻轻放置
4
只牛津杯，
其间距应相等。
每只<
/p>
牛津杯中加入
200
μ
< br>L
待测菌液（每一种菌做
2~3
个重复）
，盖好皿盖，小心移至
37
℃
培养
箱，平皿正放，静置培养。培养
20
小时后，打开皿盖，移去牛津杯，用卡尺测量抑菌圈直
径。
1.6
模拟胃液耐受性试验
将筛选得到的菌株经液体培养基活化
24h
后，
取
1.5mL
菌液于
离心管中
4000r/min
离心
1min
收集菌体，
pH6.8PBS
液洗涤
1
次，离心，
弃上
清。将菌体重
-2
-2
悬于
PBS
，梯度稀释至
10
，用移液器吸取
10
稀释液
100
μ
L
分别加入
90
0
μ
L
pH2.5
模拟
胃液（
pH2.5 PBS
中加入终浓
度
0.35%
的胃蛋白酶）和
pH6.
8
缓冲液（对照）中，
37
℃保温
-5
3
-4
-5<
/p>
3
小时。将处理过的菌液继续稀释至
10
，取
10
、
1
0
、
10
三个稀释度各
0.1mL
涂布
MRS
平板，
37
℃倒置培养
48
< br>小时，统计平板上的菌落数，计算存活率。
1.7
模拟肠液耐受性试验
<
/p>
将筛选得到的菌株经液体培养基活化
24h
后，
取
1.5mL
菌液于
离心管中
4000r/min
离心
1min
收集菌体，
pH6.8PBS
液洗涤
1
次，离心，
弃上清
。将菌体重
-2
-2
悬于
pH6.8PBS
，梯度稀释至
10
，用移液器吸取
10
稀释液
1
00
μ
L
分别加入
900
μ
L
pH2.5
模拟肠液
（
pH8.0
PBS
中加入终浓度
0.1%
的胰蛋
白酶和
0.3%
的猪胆盐）
和
pH6.8
缓冲液
（对
-5
3
-4
-5
照）中，
37
℃保温
4
小时。将处理过的菌液继续稀释至
10
，取
10
、
10
、
10
三个稀释度
各
0.
1mL
涂布
MRS
平板，
37
℃倒置培养
48
小时，
统计平板上的菌落数，计算存活率。
2
结果
2.1
菌落形态观察
分离得到的菌株
在
MRS
琼脂培养基上的菌落直径
0.
8mm
左右，
菌落扁
平，呈白色，正反
面颜色一致，稍微透明，表面略微湿润，边缘不整齐。其革兰氏染色为阳
性菌体形态均一
，呈短杆状，两端圆形，单个或成对存在，无芽孢（图
1
）
。
图
1
分离菌株的菌落形态（左）和革兰氏染色（右）
2.2
乳杆菌
PCR
鉴定结果
以分离菌
株的
DNA
为模板，用乳杆菌属特异性引物扩增出
250bp
的特异性条带，该条带大小与正对照菌株相同，且负对照无条带（
图
2
）
。该菌株初步
< br>鉴定为乳杆菌属。
1
2
3
300bp
200bp
图
2
分离
菌株的
PCR
鉴定
< br>1
、负对照；
2
、分离菌株、<
/p>
3
、
Marker
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