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枯草芽孢杆菌冷冻干燥保护剂的初步研究
摘
要:
为提
高枯草芽孢杆菌菌粉冻干存活率,对其冻干保护剂进行筛选和优化。采用单因素筛选试验和正
交试验,通过分析菌粉冻干存活率,筛选优化出最佳复合保护剂的组成。最终确定枯草芽孢杆菌最佳冻干 p>
保护剂的配方为:脱脂乳粉
10%
、
L-
抗坏血酸钠
3%
、海藻糖
2%
,菌种冻干存活率高达
(
90.01
±
1.31)%
。
本研究对枯草芽孢杆菌菌种的保藏、应用、活菌产品质量的稳定以及新产品的开发均有一定的理论
指导意
义。
关键词:
枯草芽孢杆菌;冻干保护剂;正交设计;冻干菌粉
Preliminary Research on the
cryoprotectant of
Bacillus
subtilis
Powder
Abstract
:
Study on
the technology of selection and optimization of
Bacillus subtilis
freeze-
dried
powder,
in
order
to
improve
the
survival
rates
of
Bacillus
subtilis.
The
single
factor
and
orthogonal test were taken, through
analysis of the survival bacteria, and then
optimized the best
form
of
composite
protective
agent.
The
final
determination
of the
effective
lyophilized
formulation
protection
agent:
10%
skim
milk
powder,
3%
L-sodium
ascorbate,
2%
trehalose, the results
showed the survival rates was up to (90.01
±
1.31)%. The protection agent of
Bacillus subtilis
was
optimized that provided a certain theoretical
significance for preservation and
application of
Bacillus
subtilis,
stable quality of products
and the development of new products
Keywords:
Bacillus subtilis
cryoprotectant
orthogonal design freeze-dried powder
0
引言
枯草芽孢杆菌
(
Bacillus <
/p>
subtilis)
是一种嗜温性好氧产芽孢的革兰式阳性杆菌。
该菌其生理特
征丰富多样,
分布广泛,
易分离培养,
对环境无污染,
对人畜无毒害,
< br>且能产生多种抗菌素和酶,
具有广谱抗菌活性
[1]
p>
。该菌所产的芽孢对高温和某些化学物质具有较强的抗逆性,为剂型加工及
< br>其在环境中的存活、定殖与繁殖奠定了理论基础。
枯草芽孢杆菌
(
Bacillus
subtilis
)
具有多种功能,是一种可应用于多个领域
的优良菌种,例如
可作为微生物农药、微生物饲料添加剂、生物有机肥接种剂、净水剂等
[2-3]
。近年来,随着微生
态学研
究地不断深入,
枯草芽孢杆菌作为一种有益菌得到了广泛的研究和开发。
然而,
由于长期
保存较困难,且变异机率较大,故枯草
芽孢杆菌的保藏成了研究的热门课题。
利用真空冷冻干燥保存
菌种是多种菌种保藏方法中较为理想的一种,
然而真空冷冻干燥过程
中由于环境、温度和压力的急剧变化,导致部分菌体细胞某些酶钝化、失活、细胞受到损伤甚至
死亡
[4-5]
。
因此,<
/p>
真空冷冻干燥过程中应选择合适的保护剂来降低靶标菌在冻干过程中的死亡率。
不同的保护剂对不同菌种的保护效果也不尽相同,
一般来讲,
单一保护剂的保护效果不及复配保
护剂
[6]
。只有选择合适有效的复配保护剂,使其尽可能保护靶标菌的生物活性和生理生化特征,
从而减轻冷冻和真空过程中对靶标菌的损伤
[7]
。
本研究以前期从某商品化的枯草芽孢杆菌菌粉中分离纯
化的一株枯草芽孢杆菌为研究对象,
采用单因素试验及正交试验对抗冻保护剂的组成及浓
度进行了优化,
以期最大限度地发挥保护剂
的保护功能,
减少菌体在真空冷冻干燥过程中的死亡率,
为枯草芽孢杆菌高效冻干粉
的研制提供
依据。
1
材料与方法
1
1.1
材料
1.1.1
供试菌种
枯草芽孢杆菌(肥料级)
,由三门峡龙飞生物工程有限公司、河南省农业微生物工程技术研
究中心提供。
1.1.2
培养基
牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛
肉膏
10g
,蛋白胨
8g
,葡萄糖
10g
,氯化钠
5
g
,水
1000mL
,
高压蒸汽灭菌
30min
。
计数培养基:营养琼脂。
1.1.3
保护剂溶液的配制
固体按照质量与体积比、液体按照
体积与体积比配制所需浓度的保护剂溶液。
1.2
主要试剂和仪器
1.2.1
主要试剂
脱脂乳粉为食品级,市
场购买;牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、营养琼脂粉、海藻糖、
甘油、吐温
80
、蔗糖、
L-
抗坏
血酸钠等,以上试剂均为分析纯试剂。
1.2.2
主要仪器
超低温冰箱、真空冷冻
干燥机、恒温培养箱、温控摇床、离心机、安瓿熔封机、高频电火花
等。
1.3
方法
1.3.1
工艺流程
加入保护剂
冻干前活菌计数
菌种活化
扩大培养
离心收集菌体
菌体悬浮液的制备
预冻
真空冷冻干燥
冻干粉
真空熔封
真空度检测
活菌计数
1.3.2
冻干保护剂单因素试验
取两环活化的枯草芽孢杆菌,接种于
200mLl
牛肉膏蛋白胨液体培养基中,
37
℃、
180r/min
培养
24h
。将上述发酵液
6000rpm
离心
10min
,收集菌体,用适量无菌生理盐水悬浮,
4
℃保存
备用。
参照有
关文献
[8-11]
及实验室前期的研究工作,选取脱脂乳粉、
海藻糖、甘油、吐温
80
、蔗
糖、
p>
L-
抗坏血酸钠
6
种材料作为单因素试验的筛选对象。供试保护剂的种类及浓度
见
表
1
。将保
护剂母液配制成所需浓度的
两倍,脱脂乳粉
115
℃灭菌
15mi
n
,其它
5
种保护剂溶液
121
℃灭菌
20min
,
备用。
然后将
6
种保护剂分别与菌悬液等体积混合,
制成浓菌液,
每支安瓿管
分装
2.0mL
。
预冻前先放入
4
℃冰箱中平衡
40min
< br>,
使菌体与保护剂充分混匀。
然后置于
< br>-20
℃冰箱中冷冻预冷
2h
,
随后转入
-50
℃冰箱中冷冻过夜。将冷冻后的样品安瓿管插于
真空冷冻干燥机的橡胶阀下接
口进行冻干,至菌粉的含水量降至
3%-5%
即可收获成品,真空封口并进行真空度检验,合格样
品放入
-50
℃冰箱,保存备用。
表
1
供试保护剂的种类及浓度
Table1
The kinds
and concentration of protective agents
保护剂
空白
保护剂浓度
(
%
)
加等体积的无菌水
2
海藻糖
脱脂乳
甘油
吐温
80
蔗糖
L-
抗坏血酸
2
6
1
1
2
1
4
8
2
2
4
2
6
10
3
3
6
3
8
12
4
4
8
4
10
14
5
5
10
5
1.3.3
正交试验优化抗冻保护剂
由于当正交试验做方差分析时,必须估计随机误差,故正交表
的表头中必须余留空白列,
以确定随机误差引起的离差平方和。根据单因素试验结果,本
研究建立
4
因素
3
< br>水平(包括一
列空白列)
的
L<
/p>
9
(
3
4
)
正交试验,
确定
3
种在单因素试验中有较好保护效果的保护剂的复配效果。
正交试
验影响因素水平选择见表
2
。
表
2
正交试验因素水平表
Table 2 Factor level of orthogonal
test
因素
水平
脱脂乳
A(%)
1
2
3
10
12
14
海藻糖
B(%)
2
4
6
L-
抗坏血酸钠
C(%)
1
2
3
空白
D(%)
——
——
——
1.3.4
活菌计数及冻干存活率的计算
冻干前后均采用通用检测方法
NY/T
1461-2007
进行活菌计数,菌体冻干存活率的计算公式
如下:
存活率
=
冻干后样品用生理盐水恢复至原体积测得的活菌数/冻干前
测得的活菌数×
100%
2
结果与分析
2.1
单因素试验结果
本研究将脱脂乳粉、海藻糖、甘油、吐温
80
、蔗
糖、
L-
抗坏血酸钠
6
种不同浓度的保护剂
分别进行单因素试验,
各因素均以
不加保护剂的处理为对照组。
通过分析各处理组样品冻干存活
率
,来判断其对菌体的保护作用,结果见图
1
。如图
1
所示,其中
10%
的脱脂
乳粉对枯草芽孢杆
菌的保护效果最好,菌种冻干存活率高达(
8
4.45
±
1.29
)
%
;而所对应的不加保护剂的对照组,
菌种冻干存活率
仅为(
7.85
±
1.00
)
%
。这可能是由于脱脂乳中的乳清蛋白在菌体表
面形成蛋白
膜对细胞加以保护,
同时固定酶类,
防止因细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏,
并为冻干
的样品提供了一种轻而多空的疏松结构,大大增强了菌粉的复水性,提高了菌粉的冻干存活率
[12-13]
。
其它保护
剂中,
L-
抗坏血酸钠
和
海藻糖的保护效果较好,这是因为
L-
抗坏血酸钠是
一种水
溶性极强的抗氧化剂,
能使枯草芽孢杆菌在冻干过程中免
遭氧气的影响,
保持细胞活性并提高稳
定性
[14-15]
。
另外,
海藻糖具
有多个羟基可以与菌体细胞表面自由基联结起来,
避免菌体暴露在介
质中,还可与蛋白质形成氢键以取代水,从而保证蛋白质的稳定性
[16]
。目前关于海藻糖保护机
制主要有两种假说:一种称为“水替代”假说;
另一种称为“玻璃态”假说
[17-18]
。然而,这两种
p>
假说均还不能完全解释现有的试验现象。
因此,
海藻糖保护生物活性物质的机理,
仍需深入研究。
3
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