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第十四章
利用细菌生产生物燃料的脂质
摘要
由于能源价格的上涨导致了化石
能源的短缺和环保意识的增强，
使得从可再生资源中
获取生物能
源的需求急剧增加，
特别是原油的需求。
人们希望保留其流动性
而不是旨
在通过大规模的环境、
经济和社会矛盾方面所付出的代
价。
因此，
生物燃料的生产是
很有前途
的解决方案。
本章节将讨论的是用作生物燃料的油脂的菌类产物。
例如脂肪
酸甲基酯乙基酯这些酯基代替品，
通常指定为生物柴
油；
这些酯表现出一些优良特征，
例如可生物降解，无毒，含硫
量低和含芳香化合物少。现在，各类的植物油通过化学
上的碱性催化或者酶催化的酯交换
反应生产的生物柴油，
已经被广泛的作为可再生能
源使用。
用存在于细胞内作为化合物的储存的微生物来源油来代替植物油的使用。
在
本章我们将会着重介绍体内脂质的合成和细菌的生产，
同
样也会引入细菌酰基转移酶
——对于甘油三酯和蜡酯生物合成的关键酶。
我们将会回顾尝试在大肠杆菌菌株中建
立脂肪酸乙酯的形成和讨论这个所谓微生
物柴油的前景。
前言
生物技术生产的在细菌中存储的化合物，
例如聚羟基脂肪酸，
特别是由于其可以
生物降解使得利用率大大增加。一个突出的例子是
3
－羟基丁酸和
3
－羟基
戊酸的共
聚物，
被英国帝国化学工业公司用做商业开发而且以<
/p>
“
Biopol
”
为名字在市场上销售。
除了这些已经被调查出的细菌储存化合物，其它细胞内的储存化
合物，例如藻青素，
三酰基甘油和蜡酯已经成为了科学和生物工程上的青睐物。
由于公众意识到石油储量
正在递减，
石油燃料气
体排放造成的环境恶化后果，
能源价格特别是原油价格的上涨
以
及环保意识的提高使得燃料的代替品受到越来越广泛的关注。
因此，
生物燃料的密
集研究特别是生物柴油的研究已经开始进行。
生物柴油具有许多优良的特征，
比如它
的可生物降解性，
无毒性，
含硫量低，
含芳香化合物少以及由于
它所获得的可再生资
源表现出的环境友好性。一般来说，三酰基甘油和游离脂肪酸分别通
过酯交换（图
14.1A
）和酯化作用（图
14.1B
）和短链醇（例如甲醇）反应生产出生物柴油，例如
脂肪酸甲酯和副产品甘油。
酸根的长度取决于经常以三酰基甘油为代表的脂质的生物
来源。来自不同来源的三酰基甘油作为替代燃料用于柴油机中在许多研究中都有描
述。
159
A
H
2<
/p>
C
—
OCO
—<
/p>
R
1
催化
R
1
—
OCO
—
R
‵
H
2
C
—
OH
HC
—
OCO
—<
/p>
R
2
＋
R
‵—
OH
R
2
—
OCO
—
R
‵
＋
HC
—
OH
H
2
C
—
OCO
—
R
3
酯交换
R
3
—
OCO
—
R
‵
H
2
C
—
OH
三酰基甘油
脂质
甘油
B
催化
HO
O
C
—
R
4<
/p>
＋
R
‵—
OH
R
4
—
OC
O
—
R
‵
＋
H
2
O
脂肪酸
醇类
酯化作用
脂质
水
图
14.1
三酰基甘油和游离脂肪酸分别通过酯交换（
< br>A
）和酯化作用（
B
）和短链醇
反应生产出
生物柴油。
R
1
到
R
4
代表脂肪酸侧链，
R
‵代表醇侧链。
< br>除了蜡酯和甾基酯外，三酰基甘油还作为中性脂质出现在植物、动物、酵母菌、
真
菌和细菌内。
在植物中，
三酰基甘油作为细胞内主要的储存脂质
出现在种子里。
有
趣地是，
希蒙得木种
子以长链蜡酯为储存脂质。
动物身体细胞内脂质的主要组分是三
酰基甘油和甾基酯，
主要发生在肝细胞和脂肪细胞中。
积累于酵
母菌和丝状真菌中的
脂质体类似于那些存在于植物和动物内的脂质。
细菌同样储存了相当数量的脂质比如
三酰基甘油和甾基酯。
因此，
生物柴油可以通过油的来源和通过酯交换过程中的催化剂
划分为：
（
1
）
植
物油、动物油、微生物油或废油脂与脂肪同石化甲醇进行酯交换过程；
（
2
）植物油、
动物油、<
/p>
微生物油或废油脂与脂肪通过脂肪酶、
整个细胞或者生化醇类、<
/p>
石化醇类进
行生物催化进行的酯交换过程；
（
3
）
微生物生物柴油产品，
包括通过酯交换过程后醇
类的合成。
最后一种
是自从
Kalscheuer
等等报道其合成而广受关注从而被
人认知的微
生物柴油。
160
动物，
微
A
植物，
生物
&
废油脂
< br>
酯交换
反应产物
甘油
（下层）
固定化或者来
自细菌酵母菌
真菌的游离脂
肪酶
&
醇类
碱
+
甲醇
生物柴油
（上层）
净
化
脂肪酸甲酯
甘油
回收
生物柴油
（上层）
净
化
FAAE
植物，
动物，
微
B
生物
&
废油脂
酯交换
反应产物
甘油
（下层）
甘油
基体培养
脂肪酸乙酯的
提取与纯化
FAAE
液
体
培
养基
脂
肪酸乙酯的
分离和废弃物
处理
油脂或脂肪酸
（微生
C
&
葡萄糖
物柴油原材料）
生物量
补料分批发酵
图
14.2
不同种类的生物柴油通过脂质的来源以及酒精在酯交换过程中的用途来加以区分。
我们
将生物柴油为（
A
）植物油，动物油，
微生物油脂或者废油脂与脂肪同石化甲醇进行酯交换过程；
（
B
）植物油、动物油、微生物油或废油脂与脂肪通过脂肪酶、整个细胞或者生化醇类、石化
醇
类进行生物催化进行的酯交换过程；
（
C
）
微生物生物柴油产品，包括通过酯基交换过程后醇类的<
/p>
合成。
制备生物柴油的油的酶酯基交换
细胞
外脂肪酶的使用已经被用于生产生物柴油而广泛研究，
其目的是用来缓解碱
催化的相关问题，
例如废甘油的生产和生物柴油的净化。
脂肪酸的不同来源用于甘油
三酯与短链醇类通过酯交换反应生成烷基酯的探究。
Shimada
等报道，将甲醇逐渐加
入到
油脂中可以运用一种脂肪酸，
这种脂肪酸是从固定在丙烯酸树脂中的南极假丝酵
161
母中获得。在这种固定化系统下超过
50
次的作用会使得
95%
的甲基酯发生转化因此
要尽可能避免脂肪酸作用于甲醇。在另一篇报道中，
Watanabe
等在一种批量生产系
统中运用南极假丝酵母超过
100
天而不大量减少产量，使得甲
基酯的含量增加至
93%
。非特异性酶的运用相较于配向性的脂
肪酸显示相对高的转换率，这些酶不同于
皱落假丝酵母、
洋葱假
单胞菌和荧光假单胞菌，
例如从稻根霉菌得到的脂肪酸。
当从<
/p>
稻根霉菌得到的
sn-1
（
3
）配向性脂肪酸被运用后，甲酯根在甘油三酯的
s
n-1
和
sn-3
位可以获得而不能在
sn-2
位得到。这个发现反应了非特异性脂肪酸在生产生物柴
油
中的需求。
制备生物柴油的油在整个细胞体系中的酶酯基交换
许多研究报道，
作为整个细胞生物催化剂的细菌、
酵母菌和真菌的品种是用来加
强酯交换过程的成本效益。
在建立
整个细胞生物催化体系中，
丝状真菌已经被提升为
工业酯交换和
植物油甲醇分解应用最稳健的全细胞生物催化剂。
在某些微生物细胞表
< br>面活性增强的异源表
达膜结合脂肪酶已经在不同的酯交换过程中得到应用。
Matsumoto
等从米根霉的脂肪酶中发掘了一种酵母菌细胞表面
显示系统。
运用表面表
达脂肪酶的一个主要优点是它们在醇解中
能够简单的进入到基底里，
呈现出不必要的
催化细胞预处理从而
减少产品价格。
其他的研究论述了细胞内能产生脂肪酶并含异丙
醇的酵母菌菌株的通透性，这种特性将进一步增加整个细胞生物催化的效率。
然而，
通过整个细胞催化的酯交换反应相比较于通过固定化脂肪酶进行体
外催化
的过程更耗时。一个优秀的反应速度已经分别由
Wata
nabe
和
Samukawa
等人对诺
维
信脂肪酶运用连续操作和流加操作而获得，
这种反应是运用固
定化脂肪酶进行的酯交
换反应。
相对而言，
运用批次反应而进行的整个细胞生物催化的反应速度是相当低的，
而且这种进程所要
求的时间分别超过
72
小时和
165<
/p>
小时。因此探究出更又效率的全
细胞生物催化正在进行当中。
Tamalampudi
等报道了丝状米曲菌中含有来自南极假丝<
/p>
酵母的脂肪酶编码基因的可能性，这个编码基因是一个非常有效的全细胞生物催化
剂，
它在载生物质颗粒上的固定化和在工业生物催化应用上的大大促进都
发生在水溶
液和非水溶液介质中。
此外，
非特异性脂肪酶的异性表达例如南极假丝酵母和洋葱假
单胞菌脂肪酶，
以及耐甲醇脂肪酶的异性表达可能会导致全细胞生物催化重组的发展
以及允许更
多植物油的有效酯交换。
然而，
种类
繁多的可再生植物油已经主要被运用在通过化学碱催化或者酶催化进
行酯交换从而得到生
物柴油。商业化的碱催化酯交换需要较高的温度（
160-180
℃）
，
162
< br>同时需要更高的脂肪酶消耗，
最常用的酶催化往往是那些节约能量的。
生物柴油生产
的主要花费是与油基的花费相关的。
此外，
可再生植物油的运用引起了社会问题，
因
为这些生物柴油原料的培养往往与食物和饲料的培养相竞争。
微生物柴油生产的
首要
问题是找到合适的微生物菌株，这些菌株能够重新过度生产出三酰基甘油或者蜡酯。
最近几年，
微生物脂质的积累已经作为单细胞油脂的产品来研究
，
特别是作为微生物
柴油的产品来研究。
众多含油细菌、
真菌、
酵母菌和微藻已经被报道为用来增加和
累
积大量脂质，类似于植物油、甲基酯、肥皂一样用做唯一碳源和能量来源。在此背景<
/p>
下，
用做非食品类产品的细菌作为碳源来转化三酰基甘油有可能被
用来改变生物柴油
的产品机体。
细菌中中性存储脂质的功能和发生
微
生物中积累的大量的三酰基甘油主要来源于放线菌，
尤其是分支杆菌，
< br>诺卡氏
菌，红球菌属，迪茨氏菌，戈登氏菌，小单孢菌和链霉菌。产三酰基甘油的
微生物已
经有报道是革兰氏阴性菌类，
然而相对于产蜡酯的微生
物来说数量是有限的。
三酰基
甘油在这些细菌中主要在球形脂体
中积累；
而其数量和面积取决于菌种的种类，
生长
阶段以及培养条件
（表
14.A
）
。
在这些种类中，
红球菌属
PD630
存储的三酰基甘油能
达到占细胞
干重的
89%
，
并且这些细胞里面几乎
都是直径为
50
到
400nm
的油脂体
（图
14.3
）
。这些油脂体主要组成部分为三酰基甘油（
87%
）
，甘油二酯（约
5%
）
，游离脂
肪酸（约
5%
）
,
磷脂质（
1.2%
）
,
以及蛋白（
0.
8%
）
。三酰基甘油的主要成分为棕榈酸，
油酸（
19.1%
）
，以及相当大
量的奇数脂肪酸残留物类似于十七烷酸，
（
11.4%
）和十
七碳烯酸（
10.6%
< br>）
163
图
14.3
脂质体存在于不透明红球菌
PD630
细胞内的电子显微照片
。
细胞包含了几个电子透明脂
质体（
E
T1
）
，显示了一个细小的边界膜（
B
）
。
表
14.A
细菌中三酰基甘油的生成，显示了每个细菌用来转化成三酰基甘油的碳源
和三酰基甘油
含量
细菌
革兰阳性细菌
Dietza
maris
Gordonia amarae
Micromonospora
echinospora
Mycobacterium avium
onense
棕榈酸
角鲨烯
5.0%
（
cdw
）
a
n.r.
Barksdale & Kim,
1977
a
uchel,
unpublished data
tis
ulosis
Nocardia asteroides
ina
ula
复合培养基
含甘油培养基
葡萄糖酸
十五烷
十六烷
气油
葡萄糖酸
十六烷
老
鲛烷
cta
Rhodococcus
erythropolis
ns
葡萄糖酸
十六烷
葡萄糖酸
十五烷
十
六烷
戊酸
葡萄糖
十五烷
十六
烷
戊酸
葡萄糖酸
果糖
醋酸
87.0%
（
cdw
< br>）
a
柠檬酸
琥珀酸
丙酸
戊酸
苯乙酸
橄榄油
苯癸烷
正烷烃
葡萄糖
醋酸盐
柠檬
酸
戊酸
十五烷
十六
烷
Rhodococcus
sp.
Strain
葡萄糖酸
十六烷
20
8.1%
（
cdw
）
a
Alvarez, 2003
26
.0%
（
cdw
）
a
Alvarez et al.,1997a
18.1%
（
cdw
）
a
19.3%
（
cdw
）
a
21.0%
（
cdw
）
a
n.r.
n.r.
12.2%
（
cdw
）
a
23.9%
（
cdw
）
a
18.6%
（
cdw
）
a
Akao & Kusaka, 1976
Barksdale & Kim, 1977
Alvarez,2003
Alvarez et al.,
1997a
Alvarez
et
al.,
2001;
Alvarez,2003
Alvarez,2003
Alvarez
et
al.,
1997a;
Alvarez,2003
Alvarez
et
al.,
1997a;
Alvarez,2003
Alvarez
et
al.,1996,
1997a, 2003
&
碳源
醋酸
十六烷
葡萄糖酸
十六烷
葡萄糖
甘油三酯含量
19.2%
（
cdw
）
a
6.1%
（
cdw<
/p>
）
a
8.0%
（
cdw
）
a
参考文献
Alvarez,2003
Alvarez,2003
Hoskisson et al., 2001
164
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