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什么是高通量测序?
高通量测序
技术(
High-throughput sequencin
g
,
HTS
)是对传统
Sanger
测序(称为一代测序
技术)
**
性的改变
,
一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定
,
因此在有些文献中称
其为下一代测序技术
(nex
t generation sequencing
,
NGS
)
足见其划时代的改变
,
同时高通量
测
序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能
,
所以又被称为深度测
序
(Deep
sequencing)
。
什么是
Sanger
法测序(一代测序)
p>
Sanger
法测序利用一种
DNA
聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的
引物。直到掺入一种链
终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成,每
个反应含有所
有四种脱
氧核苷酸三磷
酸
(dNTP)
,并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸<
/p>
(ddNTP)
。由于
ddNTP
缺乏延伸所需要的
3-OH
基团,使延长的寡
聚核苷酸选择性地在
G
、
A
、
T
< br>或
C
处终止。终
止点由反应中相
应的双脱氧而定。每一种
dNTPs
和
ddNTPs
的相对浓度可以调整,使反应得
到一组长几百至<
/p>
几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点,但终止在不同
的的核苷
酸上,
可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片
段,
凝胶处理后可用
X-
光胶片放射<
/p>
自
显影或非同位素标记进行检测。
什么是基因组重测序(
Genome Re-
sequencing
)
全
基因组重测序是对基因组序列已知
的个体进行基因组测序,并在个体或群体水平上进行
差异性分析的方法。随着基因组测序
成本的不断降低,人类疾病的致病突变研
究由外显子
区域扩大到全基因组范围。
通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、
双末端测序相结合
的策略进行高通量测序,实现在全基因组水平
上检测疾病关联
的常见、低频、甚至是罕见
< br>的突变位点,以及结构变异等,具有重大的科研和产业价值。
什么是
de
novo
测序
de novo
测序也称为从头测序:其不需要任何现有的序列
资料就可以对某个物种进行测序,
利用生物信息学分析手段对序列进行拼接,组装,从而
获得该物种的基因
组图谱。获得一
个
物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展,
基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低,大
规模
基因组测序渐入佳境,基因
组学研究也迎来新的发展契机和
**
性突破。
利用新一代高通量、
高效率测
序技术以及强大的
生物信息分析能力,可以高效、低成本
地测定并分析所有生物的基因组序列。
什么是外显子测序(
whole exon
sequencing
)
外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域
DNA
捕捉并富集后进行高通量
测序的基因组分析方法。
外显子测序相对于基因组重测序成本较低,
对研究已知基因的
SNP
、
Indel
等具有较大的优
势,但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
p>
什么是
mRNA
测序
(
RNA-
seq
)
转
录组学(
transcriptomics
)是在基因组学后新兴的一门学科,即研究特定细胞在
某一功能
状态下所能转录出来的所有
RNA
(包括
mRNA
和非编
码
RNA
)的类型与拷贝数。
< br>Illumina
提供的
mRNA
测序技术可在整个
mRNA
领域进行各种相关研究和新的发现
。
mRNA
测序不对
引物或探针进行设
计,可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要
一次试验
即可快速生成完整的
poly-A
尾的
RNA
完整序列信息,
并分析
基因表达、
cSNP
、
全
新的转录、
全新异构体、
剪接位点、
等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。
简单的样
品制备和数据分析软件支持在所有物种中的
mRN
A
测序研
究。
什么是
small
RNA
测序
Small RNA
(
micro R
NAs
、
siRNAs
和
pi RNAs
)
是生命
活动重要的调控因子,
在基因表达调控、
生物个体发育、代谢及
疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。
Illumina
能
够对细胞或者
组织
中的全部
Small
RNA
进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将
18-30
nt
范围的
Small RNA
从总
RNA
中分离出来,两端分别加上特定接
头后体外反转录做成
cDNA
再做进一
步处理后,
利用测序仪对
DNA
片段进
行单向末端直接测序。
通过
Illumina
对
Small RN
A
大规
模测序分析,可以从中获得物种全基因组水平的
miRNA
图谱,实现包括新
miRNA
分子的挖
掘,
其作用靶基因的预测和鉴定、<
/p>
样品间差异表达分
析、
miRNAs
聚类和表达谱分析等科学
应用。
什么是
miRNA
测序
成
熟的
mi
croRNA
(
miRNA
)是
17~24nt
的单链非编码
RNA
分子,通过与
mRNA
相互作用影
响目标
mRNA
的稳定性及翻译,最终诱导基因沉<
/p>
默,调控着基因表达、细胞生长、发育等
生物学过程。基于第二代测序技术的
microRNA
测序,
可以一次性获得数百万条
microRNA
序列,能够快速鉴<
/p>
定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的<
/p>
microRNA
及其表达差异,为研究
microRNA
对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有
力工具。
什么是
Chip-
seq
染
色质免疫共沉淀技术(
ChromatinImmunopre
cipitation
,
ChIP
)也
称结合位点分析法,是
研究体内蛋白质与
DNA
相互作用的有
力工具,
通常
用于转录因子结合位点或组蛋白特异性
修饰位点的研究。将
Ch
IP
与第二代测序技术相结合的
ChIP-Seq
技术,能够高效地在全基因
组范围内
检测与组蛋白、转录因子等互作的
DNA
区段。
p>
C
hIP- Seq
的原理是:
首先通过染色质免疫共沉淀技术
(
ChIP<
/p>
)
特异性地富集目的蛋白结合的
DNA<
/p>
片段,
并对其进行纯化与文库构建;
然后
对富集得到的
DNA
片
段进行高通量测序。
研
究人员通过将获得的数百万条
序列标签精确定位到基因组上,
从而获得全基因组范围内与组
蛋
白、转录因子等互作的
DNA
区段信息。
什么是
CHIRP-
Seq
C
HIRP-Seq( Chromatin
Isolation by RNA Purification )
是一种检测与
p>
RNA
绑定的
DNA
和蛋白的高
通量测序方法。方法是通过设计生物素或链霉亲和素探针,把目标
RNA
拉下来以后,与其
共同作用的
DNA
染色体
片段就会
附在到磁珠上,
最后把染色体片段做高通量测序,
这样会
得到该
RNA
能够结合到在基因组的哪些区域
,但由于蛋白测序技术不够成熟,无法知道与
该
RNA
结合的蛋白。
什么是
RIP-
seq
RNA
< br>Immunoprecipitation
是研究细胞内
RNA
与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网
络动态过程
的有力工具,
能帮助我们发现
miRNA
的
调节靶点。
这种技术运用针对目
标蛋白
的抗体把相应的
RNA-
蛋白复
合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的
RNA
进行测序分析。
RIP
p>
可以看成是普遍使用的染色质免疫沉淀
ChIP
技术的类似应用,但由于研究对象是
RNA-
蛋白复合物而
不是
DNA-
蛋白复合物,
RIP
p>
实验的优化条件与
ChIP
实验不太相同(如复合物
不需要固定,
RIP
反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有
RNA
酶,抗体需经
RIP
实验验证等
等)<
/p>
。
RIP
技术下游结合
< br>
microarray
技术被称为
RIP-Chip
,
帮助我们更高通量地了解癌症以及
p>
其它疾病整体水平的
RNA
变化。
什么是
CLIP-
seq
C
LIP-
seq,
又
称
为
HITS-CLIP<
/p>
,
即
紫
外
交
联
免
疫
沉
淀
结
合
高
通
量
测
序
(crosslinking-immunprecipitation
and
high-throughput
sequencing),
是一项在全基因组水平揭
示
RNA
分子与
RNA
结合蛋白相互作用的
**
性技术。其主
要原理是基于
RNA
分子与
RNA
p>
结
合蛋白在紫外照射下发生耦联,
以
RNA
结合蛋白的特异性抗体将
RNA-<
/p>
蛋白质复合体沉淀之
后,回收其中的
RN
A
片段,经添加接头、
RT-PCR
等
步骤,对这些分子进行高通量测序,再
经生物信息
学的分析和处理、总结,挖掘出其特定规律,从而深入揭示
RNA
结合蛋白与
RNA
分子的调控作用及其对生命的
意义。
什么是
metagenomic
(宏基因组)
:
< br>
Magenomics
研
究的对象是整个微生物群落。相对于传统单个细菌研究来说,它具有众多优
势,其中很重
要的两点:
(1)
微生物通常是以群落方式共生于某一小生境
中,它们的很多特
性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的,因此做
Metagenomics
研究比做单个个体的
研究更能发现其特性;
(2) Metagenomics
p>
研究无需分离单个细菌,可以研究那些不能被实验
室分离培养的微生
物。
宏基因组是基因组学一个新兴
的科学研究方向。
宏基因组学
(又称元基因组学,
环境基因组
学,
生态基因组学等)
< br>,
是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质
p>
的学科。
传统的微
生物研究依赖于实验室培
养,
元基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培养的微生物研究
的空白。过去几年中,
DNA
测序技术的进步以及测序
通量和分析方法的改进使得人们得以
一窥这
一未知的基因组科学领域。
什么是
SNP
、
SNV
(单核苷酸位点变异)
单
核苷酸多态性
singlenucleotide
polymorphism
,
SNP
或单核苷酸位点变异
SNV
。个体间基
因组
DNA
序列同一位置单个核苷酸变异
(
替代、
插入或缺失
)
所引起的多态性。
不同物种、
个
体基因组
DNA
序列同一位置
<
/p>
上的单个核苷酸存在差别的现象。有这种差别的基因座、
DNA<
/p>
序列等可作为基因组作图的标志。人基因组上平均约每
1000<
/p>
个核苷酸即可能出现
1
个单核
苷酸多
态性的变化,
其
中有些单核苷酸多态性可能与疾病有关,
但可能大多数与疾病无关。
单核苷酸多态性是研究人类家族和动植物品系遗传变异的重要依据。在研究癌症
<
/p>
基因组变
异时,
相对于正常组织,
癌症中特异的单核苷酸变异是一种体细胞突变
(
somatic mutation
)
,
称做
SNV
。
什么是
INDEL
(
基因组小片段插入)
基因组上小片段(
>50bp
)的插入或缺失,形
同
SNP/SNV
。
什么是
copy number
variation
(
CNV
)
:基因组拷贝数变异
基
因组拷
贝数变异是基因组变异的一种形式,
通常使基因组中大片段的
D
NA
形成非正常的
拷贝数量。例如人类正常染色体拷贝数是
p>
2
,有些染色体区域拷贝数变成
1
或
3
,这样,该
区域
发生拷贝数缺失或增加,
位于该区域内的基因表达量也会受到影响。
如果把一条染色体
分成
A-B-
C-D
四个区域,
则
A-B-C-C-
D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D
分别发生了
C
区域的扩增
及缺失,
扩
增的位置可以是连续扩增如
A-B-C-
C-D
也可以是在其
他位置的扩增,
如
A-C-B-
C-D
。
什么是
structure
variation
(
SV
)
:基因组结构变异
染
色体结构变异是指在染色体上发生
了大片段的变异。主要包括染色体大片段的插入和缺
失(引起
C
NV
的变化)
,染色体内部的某块区域发生翻转颠换,两条染色
体
之间发生重组
(
inter-
chromosome trans-location
)等。一般
SV
的展示利用
Circos
软件。
什么是
Segment
duplication
一般称为
SD
区域,
串联重复是由序列相近的一
些
DNA
片段串联组成。
串联重复在人
类基因
多样性的灵长类基因中发挥重要作用。在人类染色体
Y<
/p>
和
22
号染色体上,有很大的
SD
序
列。
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