-
ChIP
实验步骤
第一天：
（一）
、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1
、取出
1
平皿细胞（
10cm
平皿）
，加入
243ul 37
％甲醛，使得甲醛的终浓
度为
1
％。
（培养
基共有
9ml
）
2
、
37<
/p>
摄氏度孵育
10min
。
3
、终止交联：加甘氨酸
至终浓度为
0.125M
。
450ul 2.5M
甘氨酸于平皿
中。混匀后，在室温下放置
5min
即可。
4
、吸尽培养基，用冰冷的<
/p>
PBS
清洗细胞
2
次。
5
、
细胞刮刀收集细胞于
15ml
离心管
中
（
PBS
依次为
5ml
，
3ml
和
3ml
）
。
预冷后
2000rpm 5min
收集细胞。
6
、倒去上清。按照细胞量，加入<
/p>
SDS Lysis Buffer
。使得细胞终浓度为每
200ul
含
2×
1
06
个
细胞。这样每
100ul
溶液含
1×
106
个
细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设
MCF7
长满板为
5×
106
个细胞。本次细胞长得约为
80
％。即为
4×
106
个
细胞。因此每
管加入
400ul SDS Lysis
Buffer
。
< br>将
2
管混在一起，共
800ul
。
7
、超声破碎：
VCX750
，
25
％功率，
4.5S
冲击
，
9S
间隙。共
14
< br>次。
（二）
、除杂及抗体哺育。
8
、超声破碎结束后，
10
，
000g 4
度离心
10min
。去除不溶物质。
留取
300ul
做实验，其余保存于－
80
度。
300ul
中，
100ul
加抗体做为实验组；
100ul
不加抗体做为对照组；
100ul
加入
4ul 5M NaCl
（
NaCl
终浓度为
0.2M
）
，
65
度处理
3h
解交
联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9
、在
100ul
的超声破碎产物中
，加入
900ul ChIP Dilution Buffer
和
20ul
的
50×
PIC
。
再各加入
60ul Protein A
Agarose/Salmon Sperm DNA
。
4
度颠转混匀
1h
。
10
、
1h
后，在
4
度静置
10min
沉淀，
700rpm
离心
1min
。
11
、取上清。各留取
20ul
做为
input
。一管中加入
1ul
抗体，另一管中则不加抗体。
4
度颠
转过夜。
（三）
、检验超声破碎的效果。
取
100ul
超声破碎后产物，加入
4ul 5M NaCl
，
65
度处理
2h
解交联。
分出一半用酚
/
氯仿抽
提。电泳检测超
声效果。
第二天：
（一）
、免疫复合物的沉淀及清洗。
12
、孵育过夜后，每管中加入
60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm
DNA
。
4
度颠转
2h
。
13
、
4
度静置
10min
后，
700rpm
离心
1min
。除去上清。
14
、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在
4
度颠转
10min
，
4
度静
置
10min
沉淀，
700rpm
离心
1min
，除去上清。
洗涤溶液：
a. low salt wash buffer
----one wash
b. high salt
wash buffer-----one wash
c.
LiCl wash buffer------one wash
d. TE buffer------two wash
15
、
清
洗<
/p>
完
毕
后
，
开
始
洗
脱
。
洗
脱
液
的
配
方
：
100ul 10
％
SDS
，
100ul 1M NaHCO3
，
800ul ddH2O
，共
1ml
。
每管加入
250ul
洗脱
buffer
，室温下
颠转
15min
，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。
最终的洗脱液为每管
500ul
。
16
、解交联：每管中加入
20ul
5M NaCl
（
NaCl
终浓度为<
/p>
0.2M
）
。
混匀，
65
度解交联过夜。
第三天：
（一）
、
DNA
样品的回收
17
、解交联结束后，每管加入
1ul
RNaseA
（
MBI
）
，
37
度孵育
1h
。
18
、每管加入
10ul 0.5M
EDTA
，
20ul 1M
（
PH
6.5
）
，
2ul 10mg/ml
蛋白酶
K
。
45
度处理
2h
。
1
9
、
DNA
片段的回收
―――omega
胶回收试剂盒。最终的样品溶于
10
0ul ddH2O
。
（二）
、
P
CR
分析
二、技术总结
（一）
、关于细胞
细胞的生长状态要好。
因为细胞的生
长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，
也很有
可能影响
你所研究的
TF
与其靶
Promote
r
的结合。
一般细胞长到
75
％－
80
％比较好。
（二）
、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是
IP
级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽
量买大厂
的抗体。不推荐国产抗体和
santa cruz
的抗体，即使
是
IP
级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。
两种抗体各有利弊。
单抗特异性强，背景低。
但是单抗
有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在
ChIP
< br>甲醛交联的过程中，很有可能该位点被
其它蛋白或核酸结合而被封闭，
导致单抗不能识别靶蛋白。
多抗虽然没有这个问题，
但是多
抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与
核酸结合的区域）
，选择多抗
比较稳妥一些。
< br>
（三）
、关于交联与超声破碎！
这一块的确是
ChIP
实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联
的程度
越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其
Promoter
< br>相结合，富集得到的
Promoter
的量不高，实
验假阴性。
交联过充分，
基因组上结合了太
多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加
背景。
一般来讲，
按照我的经验，
交联条件取决于细胞类型。
不同的细胞系，
交联
的条件也不一样。
例如：
NIH
－
3T3
的交联条件是室温（
25
摄氏度）下
15min
，
1
％的甲醛浓度，而别的细胞
系则可能完全不一样。而超声破碎
的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有
bioruptor
这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是
200bp
－
1000bp
。但是
200bp
－
2000bp
的范围也是
可以接受的。
（四）
、关于操作
希望尽可能的保持低温（
4
度）
。
沉淀的时候可以先在
4
度放置一会，等它自然沉降
一些，再超低转速（
500rpm
等）离心使
< br>其完全沉降。
虽然说明书上
说
ChIP
实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你
能够连续把它做
完，直到
PCR
结果出
来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）
、关于解交联
虽然说明书上说
4
< br>小时已经足够，
但是我还是希望你可以解交联过夜。
因为
在那样的环境里，
DNA
不会降解，过夜解交联更充分些。只是
不要忘记在
EP
管口封上封口膜。
（六）
、
关于
DNA
片段的回收
需要注意的是：样品中
SDS
样品较高，普通的
终的样品中混入
SDS
，影响
PCR
实验结果。
< br>小
Tip
：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有
效的消除
一、
ChIP
是一项比较流行
的研究转录因子（
与启动子（
promoter
）相互结合的实验技术。由于
固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反
映细胞内
Promoter
的结合情况。
这个优势是
相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的
蛋白与蛋白，蛋白与核酸（
胞内，当
TF
与
Promoter
必然靠的比较近，或者契
合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它
们之间产生共价键。
一般
ChIP
的流程是：甲醛处理细胞
加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白
Protein A
，结合抗体
-
靶蛋白
的复
合物进行清洗，除去一些非特异性结合
靶蛋白
-DNA
复合物
——
解交联，
析
。
PCR
产物回收试剂盒回收，很有
可能会在最
SDS
沉淀
transcription
factor,
TF
）
ChIP
采用甲醛<
/p>
TF
与
EMSA
这个体外研究核酸与蛋白
或
RNA
）之
间会产生共价键。细
——
收集细胞，超声破碎
< br>——
-DNA
复合物相互结合
—
—
加入
-DNA
复合物，并沉淀
——
对沉淀下来
——
洗脱，得到富集的
纯化富集的
DNA
片
断
——
PCR
分
DNA
相互结合（生物意义上的结合）时，它们
-
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