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Loading
Buffer
煮细胞抽提总蛋白
Protocol
1.
细胞计数（约
< br>1
×
10
6
的细胞）
，离心收集细胞（
2000rpm
×
5min
）
；
2.
预冷
1
×
PBS
500ul
重悬洗一次，转至
500ul EP
管（
2000rpm
×
5mi
n
）
；
3.
去上清，后甩一次，将上清去尽；
4.
按每
1
×
10
6
的细
胞加
50ul
loading buffer
加入
2
×
loading<
/p>
；
5.
V
ortex
一下，煮
10
～
15min
一次×
2
～
3
次直至无粘丝；
6.
每次
煮好将其放于冰上，静置约
2min
，
V
ortex
一下，再甩一下；
7.
三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；
8.
每次上样约
5ul
（
50ug/ul
蛋白）<
/p>
RIPA
裂
解抽提总蛋白
Protocol
1.
细胞计数（约
1
×
10
7
的细胞）
，离心收集细胞（
2000rpm
×
5min
）
；
2.
预冷
1
×
PBS 1ml
重悬洗
2
次，转至
1.5ml EP
管（
2000rpm
×
5min
）
；
3.
去上清，后甩一次，将上清去尽；
4.
按照如下比例加入裂解试剂：
RIPA
：
300ul/1
< br>×
10
7
细胞
< br>
PMSF
：
3ul(1:100)
Cocktail
：
0.3ul(1:1000)
5.
吹打均匀，冰上放置
30-40min
，中间每
10
< br>分钟
V
ortex
一次；
6.
4
℃预冷离心：
10000rpm <
/p>
×
10min
；
7.
收集上清，转移至已预冷新
EP
管，即为总蛋白。
【为了浓缩蛋白，
加
RIPA
的量改为
200ul
或者更低，
可稍微延长冰上裂解时间，
而
RIPA
（
1
）＋
< br>PMSF
（
1
：
100
）＋
Cocktail
（
1
：
1000
）的比例不变
】
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