-
蛋白质提取的方法总汇
1
、植物组织蛋白质提取方法
1
、根据样品重量（
1g
< br>样品加入
3.5ml
提取液，可根据材料不同适当加入）
，准
备提取液放在冰上。
2
、
把样品放在研钵中用液氮研磨，
研磨后加入提
取液中在冰上静置
（
3-4
小时）
。
3
、用离心机
离心
8000rpm40min4℃或
11100rpm20m
in4℃
4
、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：
300ml
1
、
1Mtris-HCl
（
PH8
）
45ml
2
、甘油（
Glycerol
）
75ml
3
、聚乙
烯吡咯烷酮（
Polyvinylpolypyrrordone
）
6g
这种方法针对
SDS-
PAGE
，垂直板电泳！
2
、植物组织蛋白质提取方法
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1
、在液氮中研磨叶片
2
、加入样品体积
3
倍的提
取液在
-
20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm
以上
1
小时）弃上清。
3
、
加入等体积的冰浴丙酮
（含
0.07%
的
β
-
巯基乙醇）
，
摇匀后离心
（4℃8000rpm
以上
1
小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4
、上样前加入裂解液，室温放置
30
分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心
（15℃8000rpm
以上
1
小时或更长时间以没有沉淀为标准），可
临时保存在
4℃
待用。
2005-4-15 23:00:00
来源：生命经
5
、用
Brandford
< br>法定量蛋白，然后可分装放入
-
80℃备用。
药品：
提取液：含<
/p>
10%TCA
和
0.07%
的
β
-
巯基乙醇的丙酮
裂解液：
2.7g
尿素
0.2gCHAPS
溶于
3ml
灭菌的去离子水中（终体积为
5ml
）
，使
用前再加入
1M
的
DTT65ul/ml
。
这
种方法针对双向电泳，
杂质少，
离子浓度小的特点！
当然单向电泳也同样适用，
只是电泳的条带会减少！
3
、
组织：肠黏膜
目的：
WESTERN
BLOT
检测凋亡相关蛋白的表达
应
用
TRIPURE
提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（
1.5ml
< br>每
1mlTRIPURE
用量）
倒转混匀，置室温
10min
离心：
12000 g
，
10min
，
4
度，弃上清
加入
0.3M
盐酸胍
/95
％乙醇：（
2ml
每
1mlTRIPURE
用量）
振荡，置室温
20min
离心：
7500g
，
5 min
，
4
度，弃上清
重复
0.3M
盐酸胍
/95
％乙醇步
2
次
< br>沉淀中加入
100
％乙醇
2ml
充分振荡混匀，置室温
20 min
离心：
7500g
，
5min
，
4
度，弃上清吹干
沉淀
1
％
S
DS
溶解沉淀
离心：
10000g
，
10min
，
4
度
取上清
-20
度保存（或可直接用于
WEST
ERN BLOT
）
存在的问题
：加入
1
％
SDS
后沉淀不溶解，还是很大的一块，
4
度
离心后又多了
白色沉定，
SDS
结晶？
测浓度，含量才
1mg/ml
左右。
解决：
提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加
2X BUFFER
，然后煮
5
－
10
分钟，效果很好的。
4
、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
<
/p>
1
、
200
毫克
样品置于冰上磨碎
2
、加
lysis buffer
，离心，
10000rpm
，
4
度，
5min
取上清
3
、重复离心
5min
lysis buffer
：
urea
np-40 ampholine 2-me pvp-40
5
、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按
Davermal
等（
1986
）的方法进行。
< br>100mg
材料剪碎后加入
10mgPVP-40(
聚乙烯吡咯烷酮
)
及少量石英砂，
用液氮研磨
成粉，加入
1.5
ml
10%
三氯乙酸（丙酮配制，
含
10mM
即
0.07%
β
-
巯基乙醇），
混匀，<
/p>
-
20℃沉淀
1
小时，4℃，
15000
r/min
离心
15
min
，弃上清，沉淀复溶于
1.5ml
冷丙酮
(
含
10
mM
β
-
巯基乙醇
)
，再于
-
20℃
沉淀
1
小时，同上离心弃上清，
（有必
要再用
80
％丙酮
(
< br>含
10 mM
β
-
巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每
mg
干粉加入
20
μ
l
（可调）
UKS
液
[9.5 M
尿素，
5mM
碳酸钾，
1.25%SDS
，
0.5%DTT(
二硫苏糖醇
)
，
2% Ampholine (Amersham
Pharmacia Biotech Inc
，
pH3.5-
10)
，
6%
Triton
X-100]
，37℃温育
30min
，期间搅动几次，
28
度
（温度
低，高浓度的尿素会让溶液结冰）
16000
r/min
离心
15
min
，离心力越大时间长
一点越好！上清即可上样电
泳。或者
-70
度保存
6
、植物根中蛋白质的抽取
(1) sample,
液氮研磨
(2)
装
1.5 ml
centrifuge
用
tube
(3)
加
1M
KH2PO4+K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm,
4
度
, 10-15minite
(5)
取上层液，蛋白质就在里面
蛋白质提取方法
-------
列举
10
种方法
一、
植物组织蛋白质提取方法（
summer
）
1
、根据样品重量（
1g
样品加入
3.5ml
提取液，可根据材料不同适当加入），准
备提取液放在冰上。
2
、<
/p>
把样品放在研钵中用液氮研磨，
研磨后加入提取液中在冰上静置<
/p>
（
3-4
小时）
。
3
、用离心机离心
8000rpm40min4
< br>℃或
11100rpm20min4
℃
< br>
4
、提取上清夜，样品制备完成。
蛋白质提取液：
300ml
1
、
1Mtris-HCl
（
PH8
）
45ml
2
、甘油（
Glycerol
）
75ml
3
、聚乙烯吡咯烷酮（
Polyvinylpolypyrr
ordone
）
6g
这种方法针对
SDS-
PAGE
，垂直板电泳！
二、
植物组织蛋白质提取方法
(summer)
三氯醋酸
—
丙酮沉淀法
1
、在液氮中研磨叶片
2
、加入样品体积
3
倍的提
取液在
-20
℃的条件下过夜，然后离心（
4
℃
8000rpm
以上
1
小时）弃上清。
3
、
加入等体积的冰浴丙酮
（含
0.07%
的
β
-
巯基乙醇）
，
摇匀后离心
< br>（
4
℃
8000rpm
以上
1
小时），然后真空
干燥沉淀，备用。
4
、上样前加入裂解液，室温放置
30
分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离
心（
< br>15
℃
8000rpm
以上
1
小
时或更长时
间以没有沉淀为标准），可临时保存在
4
℃待用。
5
、用
Brandfor
d
法定量蛋白，然后可分装放入
-80
℃备用。
药品：
提取液：含
10%TCA
和
0.07%
的
β
-
巯基乙醇的丙酮
裂解液：
2.7g
尿素
0.2gCHAPS
溶于
3ml
灭菌的去离子水中（终体
积为
5ml
），
使用前再加入
1M
的
DTT65ul/ml
。
这种方法针对双向电泳，
杂质少，
离子浓度小的特
点！
当然单向电泳也同样适用，
只是电泳的条带会减少！
三、
组织：肠黏膜
（
newinbio
）
目的：
WESTERN
BLOT
检测凋亡相关蛋白的表达
应用
TRIPURE
提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中
加入异丙醇：（
1.5ml
每
1mlT
RIPURE
用量）
倒转混匀，置室温
10min
离心：
12000 g
，
10min
，
4
度，弃上清
加入
0.3M
盐酸胍
/95
％乙醇：（
2ml
每
1mlTRIPURE
用量）
振荡，置室温
20min
离心：
7500g
，
5
min
，
4
度，弃上清
重复
0.3M
盐酸胍
/95
％乙醇步<
/p>
2
次
沉淀中
加入
100
％乙醇
2ml
充分振荡混匀，置室温
20
min
离心：
7500g
，
5min
，
4
度，弃上清吹干沉淀
1
％
SDS
溶解沉淀
离心：
10000g
，<
/p>
10min
，
4
度
取上清
-20
度保存（或可直接用于
WESTERN
BLOT
）
存在的问题：
加入
1
％
SDS
后沉淀不溶解，
还是很大的一块，
4
度离心后又多了
白色沉定，
SDS
结晶？测
浓度，含量才
1mg/ml
左右。
解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加
2X
BUFFER
，然后煮
5
－
10
分钟，效果很好的。
四、
lysis solution
:
（
yog
）
Protein extraction buffer (Camiolo
buffer):
100 ml= (0.075M Potassium
Acetate) 0.736g
(0.3M) NaCl 1.753g
(0.1M) L-arginine basic salt 1.742g
(0.01M) EDTA-HCl 0.292g
(0.25%) Triton X-100 250. ul
up to 100 ml with dH20. pH 7.4. Then
0.2 um filter.
1. Freeze tissue in
liquid nitrogen.
2. Rinse in PBS then
mince.
3. Add 1 ml Camiolo extraction
buffer per 100 mg of tissue.
4.
Homogenize for 1 minute at 4'C.
5. Spin
at 3,000. rpm/15 minutes/4'C.
6. Remove
supernatant and save in another tube.
7. If necessary, dialize the
supernatant against PBS with
50mM/L
Tris-HCl pH 7.4.
五、
植物材料：水稻苗，叶鞘，根（
ynibcas
）
1
、
200
毫克样品置于冰上磨碎
2
、加
lysis buffer
，离心，
10000rpm
，
4
度，
5min
取上清
3
、重复离心
5min
lysis buffer
：
urea
np-40 ampholine 2-me pvp-40
六、
蛋白质样品制备（
sigma
）
秧苗蛋白质样品的提取按
Davermal
< br>等（
1986
）的方法进行。
100mg
材料剪碎后加入
10mgP
VP-40(
聚乙烯吡咯烷酮
)
及少量
石英砂，用液氮研
磨成粉，加入
1.5 ml 10%
三
氯乙酸（丙酮配制，含
10mM
即<
/p>
0.07%β
-
巯基乙醇），混匀，
-20
℃沉淀
1
小时，
4
℃，
15000
r/min
离心
15
min
，弃上清，沉淀复溶于
1.5ml
冷丙酮
(
含
10 mMβ
-
巯基乙醇
)
，再于
-20
℃沉淀
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