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河北经贸大学毕业论文
拟南芥蛋白不同提取方法的
SDS<
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凝胶电泳分析
专业名称：
生
物
技
术
班
级：
2003 02
学生姓名：
陈
丽
丽
指导教师：
陈
颖
完成时间
：
2007
年
6
月
河北经贸大学毕业论文
摘要
植物蛋白提取方法有很多种，不
论使用哪一种方法，均必须在操作
中保存生物大分子结构的完整性，保存活性防止变性及
降解现象的发
生。因蛋白空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇
碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失，因此选
择的条件应为十分温和。
SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术作为
分离鉴定生
物大分子的一种实验技术手段，
已经成为分子生物学
实验室中的重要技
术之一。
本试验采
用三种不同的方法（两种蛋白溶解法，一种蛋白沉淀法）
分别提取拟南芥不同组织（拟南
芥整个植株，拟南芥叶片，拟南芥愈伤
组织）的蛋白，
然后用<
/p>
SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行电泳分析，通
过分析凝胶电泳图谱比较分析不同提取液提取蛋白的效果优劣从而确
定较好的蛋
白提取法，以及拟南芥植株不同组织含有的不同蛋白。
实验结
果表明提取液
2
提取蛋白的效果最好，电泳条带最清楚，提
取液
3
即三氯乙酸丙酮次之，
提取液
1
即
PBS
溶液最次；
并且拟南芥总
蛋白跑的电泳谱带最多
且最清晰，叶片蛋白谱带最少且较模糊，说明植
物各组织的蛋白含量与种类存在差异，这
与其功能性质具有相关性，叶
片电泳谱带少说明叶片蛋白只含有总蛋白的一部分，
由于根部蛋白受培
养基中的琼脂的影响而出现一条粗带。另外，本实验
采取了快速脱色和
脱色液脱色两种不同的脱色法，
结果表明快速
脱色法不仅简单方便效果
更好适于推广致用。
关键词
S
DS
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PAGE
电泳；拟南芥蛋白；蛋
白质分析
I
河北经贸大学毕业论文
Abstract
There are many
methods of the withdrawtion of the plant proteins,
no
matter
any
method, it
must
preserve
the biology
macromolecular
structure
to be integrity in the operation,
preserve activity to prevent the degradation
and
degeneration
phenomenon.
Space
for
protein
structure
mainly
rely
on
hydrogen
bonding,
salt
bonding
and
the
Vander
Waals
bonding,
the
existence of the event acid, alkali
treatment, high temperature, Mechanical
dramatic role and strong radiation can
lead to the loss of activity, it should
choose the conditions for the very
modest. SDS-PAGE as the isolation and
identification
of
biological
macromolecules
in
one
of
laboratory
means,
it
has become one of the
important laboratory technique in Molecular
biology.
This
experiment
uses
three
different
methods
(two
methods
are
proteins todissolve solution, one
method is protein precipitation) withdraws
the tissues, protein of
Arabidopsis thaliana
( all
the protein of
Arabidopsis
thaliana
, the leaf protein
of
Arabidopsis thaliana
, the
injuries tissue protein
of
Arabidopsis thaliana
),and
then the
protein atlas in
different
tissues
and
organs of
Arabidopsis thaliana
were
analyzed with SDS polyacrylamidegel,
and then, through the analysis of the
SDS-PAGE picture we can analysis the
different
extract
buffer
and
the
different
protein
of
the
different
organizations.
Finally, the
results indicate that the best method is extract
buffer 2
—
the
SDS-PAGE
picture
is
the
clearest,
the
extract
buffer
3
that
is
the
trichloroacetic
acid
acetone
next,
the
last
is
the
extract
buffer
1
which
is
PBS. The
kinds of protein in the whole
Arabidopsis thaliana
were
most and
clearest in these three
tissues, the kinds of protein in the leaf were
least, this
phenomenon can
be explained by that the protein's content and the
protein's
type are different, this
indicates that the number of the
strip
belt band has
the relevance with the
function nature, the phenomenon that the number of
the
leaf
protein
is
the
least
indicate
that
the
content
and
type
of
the
leaf
protein
are
only
a
part
of
the
whole
protein
of
Arabidopsis
thaliana
;
as
a
II
河北经贸大学毕业论文
result
of
that
the
culture
medium
has
influence
with
the
root
protein,
the
picture
of
the
whole
protein
has
a
thick
belt.
In
addition,
this
experiment
takes two
different bleaching methods, one is rapid
bleaching, the other is
bleaching
liquid, the result shows that the rapid bleaching
method not only
simple
and
convenient,
but
also
have
a
better
effect,
so
we
can
use
it
extensively.
Keywords
SDS-PAGE
electrophoresis;
Arabidopsis
thaliana
protein;
The
protein analysis
III
河北经贸大学毕业论文
目录
1
引
言
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1
1.1
拟南芥简介
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1
1.2 SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
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2
1.3
拟南芥蛋白提取
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3
1.4
实验研究的意义
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3
1.5
展
望
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材料
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主要试剂及主要仪器
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2.1
实验材料
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4
2.1.1
拟南芥培养
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4
2
.1.2
培养拟南芥愈伤组织
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2.2
主要试剂及药品
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2.2.1
溶液的配置
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2.2.2
所用主要药品
和试剂
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7
2.3
主要仪器<
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3
实验方法
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8
3.1
样品蛋白的制备——蛋白质的提取
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8
3.1.1
提取液
1
、
2
和水提取蛋白
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8
3.1.
2
提取液
3
提取蛋白
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9
3.1.3
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
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9
4
结果与分析
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10
4.1
不同方法提取拟南芥不同组织蛋白的效果比较分析
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1
0
4.2
丙酮法提取蛋白与其它提取法的比较
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11
4.3<
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拟南芥蛋白分子量分析
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13
5
讨论
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13
< br>5.1
金属离子螯合剂在蛋白提取中起重要作用
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13
5.2
关于谱带倾斜现象
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13
< br>5.3
关于拟南芥各组织蛋白
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13
5.4
染色、
脱色<
/p>
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14
6
结论
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15
< br>参考文献
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16
致谢
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18
1
河北经贸大学毕业论文
拟南芥蛋白不
同提取方法的
SDS
—
PAGE
凝胶电泳分析
1
引言
1.1
拟南芥简介
拟南芥
（
Arabidopsis t
haliana
）
十字花科。
二年生草
本，
高
7
～
4
0
厘米。
基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄
，披针形或线形。
总状花序顶生，花瓣
4
片，白色，匙形。长角果线形，长
1
～
1.5
厘米。花
期
3
～
5
月。我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、
江苏、安徽、湖
北、四川、云南等省区均有发现
[1]
。
图
1
-
1
拟南芥花
图
1
-
2
拟南芥植株
这种植物具有以下特点：
（
1
）形态个体小，高度只有
< br>30 cm
左右；
（
2
）生长周期快，从播种到收获种子一般只需
6
周左右；
（
3
）种子多，每株每代可产生数千粒种子；
1
河北经贸大学毕业论文
（
4
）形态特征简单；
（
5
）基因组小，只有
5
对染色体。
拟南芥广泛用
于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成
为一种典型的模式植物，被科学家
誉为
“
植物中的果蝇
”
。虽然这种植物在
许多方面
“
简单
”
，
但它的大多数基因与其他
“
复杂
”
的植物基
因具有很高的同
源性，另外，由于这种植物的全部基因组测序已经完成，因此可以预测，
拟南芥在植物学所有领域的研究中将发挥更大的作用
[2]
。
1.2
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
1937
年瑞典化学家
Tiseliue
首先开发了蛋白质电泳技术，并成功地将
血清蛋白分成几个组分。原
理：迁移率是带电颗粒在一定电场强度下，单
位时间内介质中的迁移距离，可公式计算：
U=V/E=Dl/Ut
U
：迁移率
，单位是
cm/V
．
s
或
cm/V
．
min
V
：泳动速度，单位是
cm/s
或
cm/min
E
：电场强度，单位是
V/cm
D
：
泳动距离，单位是
cm
T
：电泳时间，单位是
min
或
s
L
：支持物长度，单位是
cm
SDS
是十二烷基硫酸钠（
sodiu
m dodecyl sulfate
）的简称，是一种阴离
子
表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结
合到蛋白质分子上
（在一定条件下，大多数蛋白质与
SDS
的结合比为
1.4 g
SDS/1 g
蛋白质）
，使各种蛋白质
-SDS
复合物都带上相同密度的
负电荷，其
数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原
有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根
据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分
子量
[3]
。
聚丙烯酰
胺变性凝胶电泳是对扩增产物进行检测，与其他电泳法比较
具有如下优点：①
电泳区带狭窄不易扩散，供试品用量极微，电泳分离时
< br>间短，设备简单，分辨率高，重复性佳，已广泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、
多肽的
分析鉴定和少量制备。
②
凝胶是以单
体
-
烯酰胺和交联剂，
甲叉丙烯
酰胺聚合而成的纵链交错的且有
“
分子筛效应
的三维网状结构
”
。其机械性
2
河北经贸大学毕业论文
< br>能优良，对热稳定，无色透明，无杂质，不溶于缓冲液，在
280 nm
波长处
无紫外吸收。电泳时无电渗和吸附作用，适于供试品的定量和精制
。
本实验利用
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳分别比较不同提取方法提取拟南
芥总蛋白、叶蛋白、愈伤
组织蛋白的差异以及每个提取方法的优劣。
1.3
拟南芥蛋白提取
< br>蛋白质的种类有很多，提取方法也有很多种，常用的有等电点沉淀法、
盐析法、有
机沉淀法，不同的方法对与提取不同的蛋白具有较好的效果。
即使是同一种物质的不同组
织也含不同的蛋白质，在本实验中，将采用三
种方法（两种蛋白溶解法，一种沉淀蛋白法
）提取拟南芥不同组织的蛋白
质，然后进行
SDS
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较不同的提取方法的提取
效果、不同组织的蛋白
提取情况
[4]
。
< br>不论使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性，
保存活性防
止变性及降解现象的发生。因空间结构主要依靠氢键、盐键和
范德华力的存在，遇酸、遇
碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均
可导致活性丧失，因此选择的条件应为十分
温和。同时应注意防止系统中
重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染
[5]
。
1.4
实验研究的意义
拟南芥已广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已
成为一种典
型的模式植物，被科学家誉为
“
植物中的果蝇
< br>”
。虽然这种植物
在许多方面
“
简单
”
，
但它
的大多数基因与其他
“
复杂
”
的植物基因具有很高的
同源性，该种植物的全部基因组测序已经完成。<
/p>
SDS
聚丙烯是种很重要的分离生物大
分子的实验技术，但是在实验过
程也有很多应该注意的事项。蛋白质的提取有多种方法，
本实验中将选用
三种不同的方法进行提取，然后将提取的蛋白样品进行
< br>SDS-PAGE
分析，
从而确定提取蛋白的最佳方法。
本实验通过用多种对拟南芥不同组织进行提取，提取的蛋白样
品将进
行
SDS
凝胶电泳分析，分析不
同蛋白提取法的优劣以及同一植物不同组织
的蛋白电泳差异，加强对
SDS-PAGE
的原理和操作步骤的理解和掌握。
3
河北经贸大学毕业论文
1.5
展望
提取
蛋白跑完电泳后可以做
Western
杂交，然后进行蛋白序列
分析。
Western
杂交是将蛋白
质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白
质的检测方法。先从生物细胞中提取总蛋
白或目的蛋白，
SDS-PAGE
电泳
将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜
（硝酸纤维素膜
或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温
育，以封闭其非特异性位点。然
后加入特异抗性体（一抗）
，膜上的目的蛋
白（抗原）与一抗结
合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗，
最后通过二抗上带标记化合物（一般
为碱性磷酸酶）的特异性反应进行检
测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细
胞内目的蛋白的表达
与否、表达量及分子量等情况。
Weste
rn
杂交方法灵敏度高，通常可从植物
总蛋白中检测出
50 ng
的特异性的目的蛋白
[6]
。
然后也可对已获得的目的蛋白进行蛋白序列
的分析。通常使用专一化
学试剂或具有不同水解专一性蛋白酶，得到有可能重叠的序列的
肽段，从
而推断出蛋白的氨基酸序列。蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，因
此，蛋白质序列分析对于获得有关高级结构的信息是一个很有用的基础
[7]
。
2
材料、主要试剂及主要仪器
2.1
实验材料
2.1.1
拟南芥培养
[8]
⑴
培养前预处理：拟南芥（
Arabidopsis
thaliana
，哥伦比亚野生型）种子
用
70%
乙醇浸泡
2 min
后，
无菌水漂洗
1
次，
再用
3.5
％次氯酸钠浸泡
< br>10
～
15 min
，
无菌水漂洗
5
次，
播种
于
MS
培养基上，
放入
4
℃冰箱中春化
3
天；
⑵
春化后的拟南
芥种子放入生长箱中培养，生长
7
天左右（培养箱温度周
期为
22
℃
（昼）<
/p>
/18
℃
（夜）
，光周期为
12 h
（光）
/12 h
（暗）
，光强为
120
～
130
μmol
。
2.1.2
培养拟南芥愈伤组织
[9]
⑴
挑选大而饱满的具有发芽能力的成熟种子，采取两步消毒法。剥胚前用
4
河北经贸大学毕业论文
75%
酒精中浸
1 min
，
再用
0.1%
升汞消毒
8 min
，
无菌水冲洗
5
～
6
次。
在超
净台内用镊子和解剖针仔细剥取胚，成熟胚盾片向上接种于愈伤组织诱导<
/p>
培养基上。
⑵
愈伤组织的诱导
< br>将成熟胚每瓶接种
5
粒，
接种后
在黑暗条件下培养，
温度为
18
℃，<
/p>
3
～
7
天后，开
始产生愈伤组织，
15
天后明显增大，统计愈伤组织诱导率。<
/p>
⑶
愈伤组织培养调控
愈伤组织最初多呈
水浸状，质量较差，经过改良继代，其表面长出白
色或黄色的愈伤组织，
并迅速增殖。
愈伤组织
20
天
继代
1
次，
每瓶接
3
块，
接种培养
40
天后观察愈伤状态。
愈伤组织的诱导和试管苗的分
化在诱导培养基上培养
1
周，叶段和茎
段的切口处开始膨大，两周后愈伤组织生长良好，表面呈粒状，局部变绿，
18
℃储藏以备用。
2.2
主要试剂及药品
2.2.1
溶液的配制
[10-16]
2.2.1.1
MS
培养基
MS
培养基配方：
< br>大量元素
(
母液Ⅰ
)
mg/L
NH
4
NO
3
33 000
KNO
3
38 000
< br>CaCl
2
·
2H
2
O
8 800
MgSO
4
·
7H
2
O
7 400
KH
< br>2
PO
4
3 400
微量元素
(
母液Ⅱ
)
mg/L
KI
166
H
3
BO
3
1 240
MnSO
4
·
4H
2
O
4 460
ZnSO
4
·
7H
2
O
1
720
Na
2
MnO
4
·
2H
2
< br>O
50
CuSO
4
·
5H
2
O
5
5
河北经贸大学毕业论文
CoCl
2
·
6H
2
O
5 <
/p>
铁盐
(
母液Ⅲ
)
mg/L
FeSO
4
·
7H
2
O
< br>
5 560
Na
2
< br>-EDTA·
2H
2
O
7 460
有机成分
(
母液Ⅳ
)
mg/L
肌醇
20
000
烟酸
100
盐酸吡哆醇
(
维生素
B
6
)
100
盐酸硫胺素
(
维生素
B
1
)
100
甘氨酸
400
其中诱导培养基附加植物激素
IAA0.5
－
< br>2
mg
，分化培养基附加
6BA
0.5-1 mg
，
IAA0.5
mg
，蔗糖
20 g
，琼脂
1.2%
，
pH5.8
。
2.2.1.2
蛋白提取液
1
——
PBS
溶液
称取
NaCl 0.8006
g
，
KCl 0.02012 g
，<
/p>
KH
2
PO
4
0
.02722 g
，
Na
2
HPO
4
0.3682
g
加蒸馏水溶解，定容至
100
ml
。
2.2.1.3
蛋白提取液
2
——
提取
Buffer
称取
Tris 0.1214 g
放入
洗净的小烧杯中，
然后加少量蒸馏水定容，
加盐
酸用酸度计调
pH
为
8.0<
/p>
，
再称取
SDS 0.025
g
，
DTT 0.07715
g
，
EGTA 0.09509
g
，
EDTA 0.09306
g
加入上述溶液，
最后用
100 ml
的定量瓶定容，
放入冰箱
待用。
该提取
Buffer
最后各成分浓度为：
5 m mol/L
EDTA
5 m mol/L
EGTA
10 m mol/L
DTT
0.05 m mol/L
SDS
20 m mol/L
Tris-HCl pH 8.0
2.2.1.4
蛋白质提取液
3
——
三氯醋酸
—
丙酮
提取液：含
10%TCA
和
0.07%
的
β
-
巯基乙醇的丙酮。
裂解液：
2.7
g
尿素
0.2 g
CHAPS
溶于
3
ml
灭菌的去离子水中（终体积
为
5
ml
）
，使用前再加入
1M
的
DTT 65
μl/ml
。
2.2.1.5
Loading
buffer
（
10 ml
1×
）
1 mol/LTris-
HCl(pH6.8)
0.625 ml
6
河北经贸大学毕业论文
β
－巯基乙醇
0.25 ml
10% SDS
1
ml
溴酚蓝
0.1125 ml
50
％甘油
0.5 ml
蒸馏水
2.5
ml
2.2.2
所用主要药品和试剂
拟南芥种子—哥伦比亚野生型（河北师范大学）
母液Ⅰ
母液Ⅱ
盐酸吡哆醇
(
维生素
B<
/p>
6
)
盐酸硫胺素
(
维生素
B
1
)
甘氨酸
氯化钠（天津北宏试剂厂）
琼脂粉（北京奥博星生物技术责任有限公司）
磷酸二氢钠（天津科盟化工工贸有限公司）
磷酸氢二钾（天津科盟化工工贸有限公司）
SDS
（北京赛弛生物科技有限公司）
EGTA
（天津东丽区华明镇北于堡工业区）
< br>
EDTA
（河北博海生物工程有限公司）
DTT
—
二硫苏糖醇
丙酮
β
-
巯基乙醇
9.5 M
尿素
5 m M
碳酸钾
丙三醇二甘油（天津永大化学试剂开发中心）
甲叉双丙烯酰胺（北京海淀区土地四街）
Tris
（华美生物工程有限公司）
甘氨酸（河北博海生物工程有限公司）
丙烯酰胺（天津科密欧）
考马斯亮蓝
R-250
（天津永大）
四甲基乙二胺（即
TEMED
）
< br>
过硫酸胺
7
河北经贸大学毕业论文
Marker
溶液
脱色液
2.3
主要仪器
电子分析天平
BS1245
（北京赛多利斯仪器系统有限公司）
超净工作台（哈尔滨）
高压灭菌锅
海尔冰箱
DYY-
< br>Ⅲ
4
电泳仪
(
< br>北京六一仪器厂
)
DYY-
Ⅲ
28A
型垂直夹心式电泳槽
(
北京六一仪器厂
)
制冰机（
< br>SANYO
）
离心机
Beckman Incubator (Avanti
j-25)
微电脑电磁炉（佛山）
脱色摇床（上海智城）
3
实验方法
3.1
样品蛋白的制备——蛋白质
的提取
[11-16]
3.1.1
用提取液
1
、
2
和水提取蛋白
⑴
选取生长较好
的拟南芥，分别称取叶片、拟南芥植株、愈伤组织各
1
g
，
分别放入预冷好的三个研钵中。
⑵
分别向三个研钵中加入液氮研磨样品，直至呈粉末状为止。
⑶
向已编号的离心管（
1.5 ml Eppendorf
管，以下简称
EP
管，编号分别为
LFbuffer1
、
LFbuffer2
、
LF
水、
AT
buffer1
、
AT buffer2
、
AT
水、
YSh
buffer1
、
YSh
buffer2
、
< br>YSH
水，其中，
LF
：叶蛋白
，
AT
：总蛋白，
YSh
：愈伤组
织蛋白。
）中预先加入
100 μl
提取液
1
、
2
、
3
和水。
⑷
将加好的样品摇匀，迅速放入冰中备用。
⑸
将六只离心管放入提前设好温度的冷冻超速离心机中以
12
000 rpm/min
4
℃离心
10
min
。
⑹
LFbuffer1
、
LFbuffer2
、
BF
水、
AT
buffer1
、
AT buffer2
、
AT
水、
YSh
buffer1
、
8
河北经贸大学毕业论文
YSh bu
ffer2
、
YSh
水这些
EP
管分别取上清液，
分别加入已编号的九个新的
EP
管中。
⑺
再次将九只离心管放入冷冻超速离心机中
12
000
rpm/min
4
℃离心
10min
。
⑻
按照步骤⑹再次取上清或去上清将
所需要的物质加入新的已编号的离
心管。
⑼
分别加入与样品等量的
Loading
Buffer
，放入沸水中煮
10 <
/p>
min
，然后迅
速放入冰上冷却，然后<
/p>
12 000 rpm/min
离心
5
min
，备用。
3.1.2
提取液
3
提
取蛋白
⑴
分别
称取
拟南
芥
植株，
叶片
，愈
伤组
织各
1
g
，
剪碎
后加
入
10
mgPVP-40(
聚乙烯吡咯烷酮
)
及少量石英砂，用液氮研磨成粉。
⑵
加入
1.5 ml 10%
三氯乙酸（丙酮配制，含
10
mmol
即
0.07% β
-
巯基乙
醇）
，混匀，
-
20
℃沉淀
1
小时，然后
4
℃，
15 000
rpm/min
离心
15
min
。
⑶
弃上清，沉淀复溶于
1.5 ml
冷丙
酮
(
含
10mmol
β
-
巯基乙醇
)
，再于
-20
℃
沉淀
1
小时，同上离心弃上清。然后干燥沉淀，保存备用。
3.1.3
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶电泳
[3
17-19]
3.1.3.1
SDS-
聚丙烯酰胺凝胶制备
⑴
配置分离胶溶液
分离胶
8%
（
10
ml
）：
A
液
2.7 ml
，
B
液
2.5
ml
，蒸馏水
4.8 ml
，
10%
过硫酸胺
50
μl
，
TEMED 5
μl
。
⑵
配置浓缩胶溶液
浓缩胶
3
％（
4
ml
）：
A
液
0.67
ml
，
C
液
1.0 ml,
蒸馏水
2.3
ml, 10%
过硫酸铵
30
μl,
TEMED 5
μl
。
⑶
电泳缓冲液（
Tris-
甘氨酸缓冲液
pH
8.0
）：
称取
Tris 4.0
g
，
甘氨酸
14.4
g
，
SDS 1.0
g
，用无离子水溶解后定容至
1
L
。
3.1.3.2
样品的处理及加样
提取液
1
、
2
和水提取的蛋白样品可充分混合后可直接上样。提取液
3
提取的蛋白样品需充分混合后加
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后，最好离心
5
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后才上
样。用微量进样器取
30
μl
上述混合液，通过缓冲液，小心地将样
品加到凝
9
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