-
自噬双标腺病毒
(
mRFP-GFP-LC3
)
使用指南
背景：
自噬是细胞内的一种“自食<
/p>
(
Self-eating
)”的现象，凋亡是“自
杀
(
Self-killing
)”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，
但是诱发
阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚
.
自噬是指
膜
(
目前来源还有
争议，
大部分表现为双层膜，有时多层或单层
)
包
裹部分胞质和细胞内需降解
的细胞器、
蛋白质等形成自噬体，
最后与
溶酶体融合形成自噬溶酶体，
降
解其所包裹的内容物，
以实现细胞稳
态和细胞器的更新。
目前文献对自噬
过
程进行观察和检测常用的策略
和手段有：通过
western blot
检测
LC3
勺剪
切；通过电镜观测
自噬体
的形成；在荧光显微镜下采用
GFP(-RFP
)
-LC3
等融<
/p>
合蛋白来示踪自
噬体形成以及降解。
近几年对自噬流的研究日趋增多，
针对
于此我们
汉恒生物科技
(
上海
)
有限公司自主研发了用于实时监测自噬
(
流
)
的
mRFP-GFP-LC
腺病毒，<
/p>
mRFP
用于标记及追踪
LC3,
GF
啲减弱可指
示溶酶体
与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于
GF
荧光蛋白对
酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后
GFP
荧光发生淬灭
,
此时只能检
测到红
色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了
细胞自噬流的水
平，
是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利
器。
mRFP-GFP-LC3
腺病毒的操作
收到病毒后的处理
（一）、腺病毒的储存
1
、腺病毒采用冰袋运输。
（
1
）
、收到病毒液后如未融化请置于
-80
C
冰箱，下次使用时再进
行分
装；
（
2
）
、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于
-80
C
冰箱
保<
/p>
存；若短期内用于实验，可分装部分于
4
C
保存（尽量一周内用完）。
2
、
尽
量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病
毒滴度
10%
）。建议不要在
-20
C
下长期保存。如果病毒储存时间超
过
6
个月，
应该
重新测定病毒滴度。
3
、
建
议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的
小包装病
毒产品（购买时请提出）。
（二）、腺病毒的稀释
需要稀释病毒时，
将病毒取出后置于冰上融解，
使用培养目的细胞
用
PBS
或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后
4
C
保存，并尽快用于
实验（尽量一
周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释，
并尽快用完。
感染目的细胞
由于腺病毒是自主复制性基因载体，不能插入基因组稳定遗传，
因此实验中细胞感染腺病毒的实验需要具体情况具体对待。
一般根据
外界刺激处理的时间来选择感染腺病毒的时间，
短时程处理（一周之
内）建议先感染腺病毒之后再进行处理，
长时程刺激的建议在刺激结
束前
2~3
天进行腺病毒感染。另外不同细胞的
MOI
不同，所以在将
病毒感染正式感
染目的细胞前，需要做一个预实验以确定目的细胞中
加入的病毒数。
（一）细胞准备
将状态良好的目的细胞接种到
24<
/p>
孔板
,
使细胞浓度为
1
x
10
/ml
细胞，
接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，
一般是保证第二
天进行病毒感
染的时候细胞汇合率介于
50%
至
70%
直接。
5
（二）病毒感染
I
、贴壁细胞
由于该病毒感染后续拍照需要进行自噬小点的计算，
因此需要在
高倍镜下拍照，条件允许最好使用共聚焦显微镜拍照，
此时需要把细
胞铺被
在玻片上面（部分细胞铁壁能力不是很强，此时需要预先在玻
片上包被
galetin
甚至
laminin
）。感染实验在
1/2
体积培养液感染
（详见下表格）。
加入的病毒量范围在
MOI=20-50
内（具体感染的
操作量参见附录表格），每
个
MOI<
/p>
值加两个孔
2
小时后换液。
病毒小培养体积感染表
培养皿
类型
96-well
24-well
表面积
/cm
2
0.3cm
2
c 2
2cm
4cm
2
10cm
2
20cm
2
对应细胞培养液体积
病毒感染对应细胞培
养
液体积
100ul
500ul
1ml
2ml
4ml
50ul
250ul
500ul
1ml
2ml
5ml
12-well
6-well
60mm
100mm
60cm
2
10ml
感染
2
小时后直接换液
II
、悬浮细胞
上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法，若是悬浮或半悬浮细
胞，则需要
通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培
养皿
后，封好口，放入平
角离心机后，低速离心
1h
,
然后放入培养箱中
正常培养即可。若由于实验条件
有限，没有平角离心机，可用离
心管
代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低
速离心，去掉大部分上清，
然后加入适量的病毒液，室温放置
10min
（不能
超过半小时），然后
将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至
2
小时后换
液即可。
（三）
观察感染情况
感染
< br>24
小时后，可以开始观察到
GFP
以及
RFP
表达，
36-48
小时
可以进
行细
胞固定、圭寸片（需要使用防淬灭的固定剂）、拍照分析。
（四）
结果分析
mRFP-GFP-
LC
串联荧光蛋白腺病毒中表达的
G
FF
和
mRF
用于标
< br>
记及追踪
LC3
GFP
的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬
溶酶体（由
GFP
荧光
蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后
GFP
荧光发生淬灭
，
此时只能检测
到红色荧光，原理如下图所
/
示）。
Lysosome
。
Suppression at
early
stage
1
luoresoent
signals of
puncta
Suppression at l^te
typical
results of autophagic flux
Basal level
Induction
Suppress
LOTI
at
Suppression
ear
ly stage
late
stage