Taqman设计总结

C

的含量要明显高于

G

的含量，

G

的含量多于

C

会降

低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反 两条链上设计

引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段 ，且这个不

同的碱基最好在探针的中间，且最好为

A

T

。

⑥

Repeating oligonucleotides

：

a.

< br>避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免

4

个或超过

4

个的

G

碱基 出现，即≦

3

（

Avoid

runs

of

identical

nucleotides.

If

repeats

are

present, there must be fewer than four consecutive G residues.

）

；

b.

避免连续的

6

个

A< /p>

出现

（

Consecutive

A

residues

：

Avoid

six

consecutive

A

residues

anywhere

in

the

probe.

Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal

）

；

c.

避免探针的

中间区域含有

2

个或以上的

CC dinucleotides

（

Avoid two or more CC dinucleotides in the

middle of the probe, which can sometimes reduce signal

）

。

⑦

检测探针的

DNA

折叠和二级结构

（最大连续的碱基配对数

=4

：

Maximum number

of consecutive base pairings allowed in a primer=4

；最大的总的碱基配对数

=8

Maximum

number of base pairings allowed in a primer=8

）

：

a.

避免自身形成环状发卡结构（

Hairpin

Loops

：

If a DNA strand possesses a self-complementary sequence, it may form a secondary

structure, often called a hairpin loop. When designing primers or probes, avoid regions that

tend to form secondary structures. If secondary structures are present, primers or probes must

compete against the complementary strand for binding to the target sequence, which reduces

PCR efficiency.

）

，

b.

避免自身二聚体形成（

Self- Dimers

：

Primers or probes that possess 3

?

complementarity

with

themselves

in

the

PCR

reaction

may

form

another

type

of

nonspecific

product,

a

self- dimer.

Nonspecific

product

formation

decreases

the

quantity

of

specific product produced and may add ambiguity to the PCR results. The Primer Express?

software calculates and eliminates from consideration most of the primers and probes that are

self-complementary

or

possess

strong

self-dimer

tendencies.

）

，

c.

避免交叉二聚体形成

（

Cross- Dimers

：

Primers

or

probes

that

possess

3

?

complementarity

with

themselves

or

another primer or probe in the PCR reaction may form another type of nonspecific product, a

cross-dimer.

Nonspecific

product

formation

decreases

the

quantity

of

specific

product

produced

and

may

add

ambiguity

to

the

PCR

results.

The

Primer

Express

software?

calculates

and

eliminates

from

consideration

most

of

the

primers

and

probes

that

are

self-complementary or possess strong dimer tendencies.

）

。

⑧

可选

：

3'

端的淬灭基团也可以标记在探针的内部核酸上。

5'

端染料最好连接在

T

或

C

碱基上。

⑨

可选

：< /p>

探针应高度纯化

（

HPLC

）

；探针储存液应为

100um

浓度，

工作液为

10um

浓度并分 装

25ul/

份。

⑩

反应体系中

探针浓度的优化

主要依靠背景信号强度、

探针与靶的结合效率 、

PCR

扩增的效率、引物的浓度等进行优化。一般探针浓度在

0.1~0.4uM

范围内进行优化。若

用新合成的探针进行优化时，

一般从

0.2uM

开始对探针进行优化。

目的是既使背景荧光

最小化，

又没有降低实验的敏感性，

从而得到最佳实验结果。