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激光共聚焦显微镜的原理和应用
李
楠
王黎明
杨
军
关键词
激光
;
显微镜
;
原理和作用
中国图书资料分类法分类号
R
318. 51
激光共聚焦显微
镜是
80
年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品
,
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置
,
利用计算机进行图象处理
,
使用
紫外或可见光激发荧光探针
,
从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象
,
在亚细
胞水平上观察诸如
Ca
2+
、
pH
值
, ,
成为形态学
, , ,
学
, 1994,
了目前世界次最高
,
功能最全的美国
M eridian
公司的产品
:A cas
系列
U lti m a
型和
扫描速度最快的
In sigh t
型两台激光共聚焦仪。
仪器自
1995
年
5
月份到
货安装以来
,
已为我院
7
个科室的
10
个课题所应用
,
目
前主要开展的研究内容有
:(1
细胞内游离钙的实时监测
; (2
细胞通讯的研究
; (3
细胞
形态学的研究。
1
基本原理和功能
1.
1
基本原理
传统的光学显微镜使用的是
场光源
,
标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰
;
激光
共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦
平面上的每一点扫描
,
标本上的被照射点
,
在探测针孔处成像
,
由探测针孔后的光电倍增管
(PM T
或冷电耦器件
(cCCD
逐点或逐线接收
,
迅速在计算机监视
器屏幕上形成
荧光图象。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭
< br>
作者单位
解放军总医院实验仪器中心
,
北京
100853
的
,
焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔
,
焦平面以外的点不会在探测
针孔处成像
,
这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面
,
克服了普通显微镜图象模
糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达
,
可使载物台上下步进移动
,
最小步进
距离为的
0.
1Λ
m ,
能清楚地显示
,
实现了的目的
,
这就是
21. . CT
”
功能
通过狭缝
扫描技术
< br>将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平
,
使图像更加
清晰
,
从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
1. 2. 2
三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能
< br>激光共聚焦显微成像仪
可以将断层图像与三维重建图像有机的结合起来
,
不但能揭示细胞内部的结构和提
供细胞的长、
宽、厚、断层面积、细胞体积等参数
,
而且可以给人以三维立
体的概
念。例如
:
可以使细胞旋转起来
从而能随意观察细胞各个侧面的表面结构。
1. 2.
3
将形态学、生理学与分子细胞生物学的
研究相互结合
利用激光共聚集显微成像仪不但可以观察细胞形态的动态变化
,
而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。如细胞内游离
Ca 2+
、
pH
值及其它
细胞内离子的实时测定。荧光原位杂交的杂交点观测和定量分析。
1. 3
激光共聚焦显微成像仪的细胞生物学功能
1. 3. 1
粘附细胞分选技术
U lti m
a
型激光共聚焦显微成像仪是目前世界上
唯一能对粘附细胞进
行分选的仪器
,
而这种不改变细胞周围培养环境
,
细胞铺展程度
和生长状态的分选方式
?
232
?
军医进修学院学报
1996Sep
t 17(3
是至关重要的。
1. 3.
2
细胞激光显微外科及光陷井技术
该仪器可将激光当作一把
“
光刀子
”
使用
,
完成诸如细胞膜瞬间穿孔
,
染色体切割
,
神经元突起切除等一系
列细胞外科手
术
,
也可以作光陷井操作。
1. 3.
3
荧光光漂白恢复技术
该技术用来测定活细胞的动力学系数。通过对
活细胞的动力学系数的测定<
/p>
,
可对细胞骨架构成、核膜结构、大分子组装和径跨膜
大分子迁移率等领域进一步研究。
1. 3.
4
光活化技术
该技术通过笼锁与解笼锁测定
,
可以
人为控制多种生物活
性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间。
1. 3. 5
析
,
重要的意义
1. 3. 6
胞间通讯的研究
通过测量细胞缝隙连接的分子
转移
,
研究相邻细胞间的通讯。此项研究用于监测环境毒素和药物在细胞增殖和分
化中所起的作用
,
肿瘤启动子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的作用
,
以及细
胞内
Ca
2+
, pH
和
CAM P
对缝隙连接作用的影响。
2
应
用
2. 1
细胞内游离钙测定
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