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染色质免疫沉淀技术（
ChIP
）实验方法
实验原理
染色
质免疫沉淀技术（
ChIP
）通过与染色质片段共沉淀和
PCR
技术，在体
内检测与特异蛋白质结合的
DNA
片段。
ChIP
技术最大的优点就是在活体细胞状
态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少
了体外实验的误差。在活体细胞
中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一
定的方法（例如：超
声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过
一定手段
把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用
PCR
等方法检测鉴定共沉淀的
DNA
片
段的特性。
仪器和试剂
真空设备、涡旋器、液氮
、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、
miracloth
37%
甲醛，
2M
甘氨酸，
ddH
2
O
，剪切的鲑精
DNA/protein
A
琼脂糖珠
(Sant
cruz)
，
蛋白酶
K
（
14mg/ml
）
,RNaseA,
酚：氯仿：异戊醇（
25<
/p>
：
24
：
1
）
,
氯仿
,
无水
乙醇
,
提取缓
冲液
1
（
EB1
）
:0.4M
蔗糖；
10mM
Tris-HCl
，
pH8.0
；
5mM
β
-ME
；
0.1mM PMSF
；蛋白酶抑制剂混合物（
aprotinin
、
pepstain A
、
Leupeptin
、
Antipain
、
TPCK
、<
/p>
Benzamidine
）
提取缓冲液
2
（
EB2<
/p>
）
:0.25M
蔗糖；
10mM Tris-HCl
，
pH8.0
；
10mM
MgCl
2
；
1%Triton
X-100(
聚乙二醇辛基苯基醚
)
；
5mM
β
-ME
；
0.1mM
PMSF
；蛋白酶抑制剂混合物（同上）
提取缓冲液
3
（
EB3
）：
1.7M
蔗糖；
10
mM Tris-HCl
，
pH8.0
；
0.15%Triton
X-
100
；
2mM MgCl
2
；
5mM
β
-ME
；
0.1mM
PMSF
；蛋白酶抑制剂混合物（同上）
核裂解缓冲液（
NLB
）：
50m
M Tris-HCl
，
pH8.0
；
10mM EDTA
；
1%SDS
；
PMSF
和
蛋白
酶抑制剂混合物（同上）
ChIP
稀释缓冲液（
ChIP
DB
）：
1.1%Triton
X-100
；
1.2mM
EDTA
；
16.7 mM
Tris-HCl
，
pH8.0
；
167mM NaCl
；
< br>PMSF
和蛋白酶抑制剂混合物（同上）
洗脱缓冲液（
EB
）：
1%
SDS
；
0.1M
NaHCO
3
（现配）
低盐洗脱液：
150mM NaCl
；
0.1%SDS
；
1%Triton
X-100
；
2mM
EDTA
；
20mM
Tris-
HCl
，
pH8.0
?
高盐洗脱液：
500mM NaCl
；
0.1%SDS
；
1%Triton
X-100
；
2mM
EDTA
；
20mM
Tris-
HCl
，
pH8.0
LiCl
洗脱液：
0.25M LiC
l
；
1%NP-40
；
1%
脱氧胆酸钠；
2mM
EDTA
；
20mM
Tris-
HCl
，
pH8.0
TE
缓冲液：
1mM
EDTA
；
10mM Tris-
HCl
，
pH8.0
实验方法
植物材料的准备
（以拟南芥为例）
<
/p>
1
．在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。
< br>
2
．约
3
周后，在
50ml
管中收集
1.5
g
的幼苗，无菌水洗
2
次。
甲醛固定
4
．室温下把幼苗浸在
37ml
含
1%
的甲醛的
E
B1
液中，抽真空
10min
。
5
．加入
2M
甘氨酸使终浓度至
0.125M
，中止反应
，继续抽真空
5min
，此时幼苗
应该
变为半透明。
(
加
2M
甘氨酸约
2.5ml)
6
．
用
40ml
水洗幼苗
3-4
遍。
7
．去除幼苗水分
，将幼苗液氮冷冻
-
80℃
保存或继续
进行下面操作。
分离和超声染色质
（
注：除特殊注明，所有操作都在
4℃
进
行）
8
．液氮预冷研钵和杵子，液氮
研磨幼苗成粉末状。
9
．在
50ml
管中加入
30ml EB1
悬浮组织。
(
此时，
EB
1
中不含甲醛
)
10
．
4
层
miracloth<
/p>
过滤组织到一个新的
50ml
管中。
11
．
4℃
，
2880g
离心
20min
。
12
．小心去上清，
1ml
EB2
重悬沉淀。
13
．转移至一个新的
1.5ml
离心管。
14
．
4℃
，
12000g
离心
10m
in
。
15
．
300ul
EB3
重悬沉淀。
16
．转入另一已加入
300ul
EB3
新管中。
17
．
4℃
，
16000g
离心
1
小时。
18
．去上清，
300ul NLB<
/p>
重悬沉淀（
4℃
操作），涡旋，用枪头吹
打，保留
10ul
溶液做后续检测。（在上胶前，该溶液按下面
DNA
解交联的操作步骤一样）
19
．超声波处理溶液，打断
DNA
成约
0.5-2kb
的
DNA
片段。打断的染色质可以
-
8
0℃
保存，或进行后续操作。
免疫沉淀
20
．
4℃
，
16000g
离心
5min
沉淀碎片。
21
．转移上清到一个新管。保留
10
ul
溶液去检测超声效率（按第
35
步
往后处
理）做后续检测
(
以第
18
步保留的溶液做对照，电泳检测
DNA<
/p>
片段的长
度
)
。
22
．分
2
00ul
到
2
个新管，每管
100ul
。
23
．每管加
900ul ChIP<
/p>
稀释液，使
SDS
浓度变为
0.1%SDS
。
24<
/p>
．每个样品加
4
—
40ul
剪切的鲑精
DNA /
蛋白
A
琼脂糖珠（用前，珠必须洗
3
次，然后重悬于
ChIP
稀释液中），
4℃
，轻轻晃动
1
小
时。（注：鲑精
DNA /
蛋白
A
琼脂糖珠的用量需要根据购买的产品质量进行调整）
25
．
4℃
，
16000g
离心
2min
。
26
．合并
2
管上清（约
2ml
），分装
2ml
到
3
个
EP
管中（每管
666ul
< br>）。
27
．加
4ul
抗体到其中的
2
管中，
另一管作为阴性对照。
28
．
4℃
过夜，并轻轻晃动。
< br>29
．再加
4
—
40ul
剪切的鲑精
DNA /
蛋白
A
琼脂糖珠（事先用
ChIP<
/p>
稀释液洗涤
处理），
4℃
轻微晃动
1
小时，收集免疫沉淀。
30
．准备新鲜的洗脱缓冲液（
1%SDS
，
0.1M
NaHCO
3
，现配）。
31
．
4℃
，
16000g
离心
2min
，取沉淀，每次
1ml
洗脱液洗沉淀
10min
。洗脱液
顺序如下：
（
1
）
低盐洗脱液
1
次
（
2
）
高盐洗脱液
1
次
（
3
）
Li
Cl
洗脱液
1
次
（
4
）
TE
缓冲液
2
次
最后，去除
TE
缓冲液。
洗脱和染色质的解交联
32
．加
250ul
新鲜的洗脱缓冲液（第
30
步已准备）到沉淀珠中，以释放和珠结
合复
合物。
33
．混匀，
65℃
水浴
15min
，轻微
晃动。
34
．小心取上清转移到新管
，重复洗涤珠，合并
2
次洗液。
35
．加
20ul 5M NaCl<
/p>
，
65℃
孵育过夜，以解染色质的固定。
36
．加
10ul 0.5M
EDTA
，
20ul 1M Tris-HCl
，
pH6.5
，和
1.5ul
14mg/ml
的蛋
白酶
K
，
65℃
温育
1
小时。
37
．等体积
酚
/
氯仿抽提
DNA
< br>，在有
novagen pellet paint
存在
的情况下乙醇
沉淀
DNA
，
70%
乙醇洗沉淀。
3
8
．用
40-50ulTE
缓冲液（含
10ug/mlRNase A
）溶解
DNA
。纯化的
DNA
片段可
用于
PCR
扩增检测目的基因，或者可用多重<
/p>
PCR
来鉴定目的基因的有无
（与内参对
照）。
39
．在
25ulPCR
体系中，模板加
0.5ul
。模板的变化依赖于免疫沉淀的效果。
附：剪切的鲑精
DNA /
蛋白
A
琼脂糖珠混合物（
1M Tris-HCl
，
pH6.5
；
5MNaCl
；
0.5M EDTA
，
65℃
加热封闭）（玻璃珠规格：
2
12- to 300-um diameter;
sigma
）
制备方法：
1
．制备
100ml
灭菌
TE
（
10 mM
Tris
，
pH
8.0
；
1 mM
EDTA
，
pH
8.0
）
2
．结合：
50mgBSA
（做稀释抗体用）；
< br>0.5ml
叠氮化钠（从
5%
的
储存液中吸取），
补充
TE
到
47.5ml
，
0.2 u
< br>滤膜过滤（溶液
II
）。
3
．用
15ml
灭
菌
TE
洗
20ml
蛋白
A
珠（
50% slurry
）
2
次。
4
．结合：
10ml protein
A
，
4mg
剪切的
ssDNA
，
20ml
灭菌的溶液
II
，
4℃
振
摇
45
分钟。
5
．分装
4℃
保存
< br>
注意事项：
1
．材料固定要充分，使其全部沉到底部。抽气后在冰上固定半小时，固定时
间
勿太长，否则可能会影响之后的抗体结合。
2
．
16
步中重悬物轻轻滴加
在另一新管中的
EB3
上。
3
．
19
步中超声条件
根据不同材料调整，如
100W,
超声
10
秒，间隔
15
秒，超
声
4
次。
4
．
24
步中洗蛋白
A
琼脂糖珠时可将琼脂糖珠轻轻弹开，混合均匀，以便充分
洗涤。
5
．
31
步中洗脱过程中也要轻轻弹开琼脂糖珠。
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