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Prescission
蛋白酶制作及使用方法
柱下酶切用酶的制作方法
1L TB
菌体用
PBS
重悬至
< br>35ml
做高压裂解，最终
40ml
总量。上清用
0.5ml
流速，挂
3-4ml
柱子，
PBS
漂洗
30ml
。用含有
10%
甘油的洗脱液洗脱，每管收集体积为
2ml
，只取主峰，可以
粗略定量，也可以
取百分之一的量在
Akta
< br>上用上样泵来做积分定量
（参考下面的积分定量方法举例）
。
也可以用分光光度
计定量，一般可用稀释
< br>20
倍定量。马上分装成
0.25mg
< br>每管，可切
5ml
介质。
柱上酶切用酶的制作方法
亲和纯化方
法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，得到
10ml
左右洗脱液，浓
缩
10
倍，再加入
10ml
含有
10%
甘油和
2m
M
DTT
的
PBS
< br>稀释，一共浓缩三次换
buffer
，每次浓缩时间一般
在
30
分钟以内。最终
浓缩至
10mg/ml
，浓缩
10
分钟混匀一次。尽快分装成
0.25mg
每管，可切
5ml
介质。
柱上
酶切用酶的
Q
纯化制作方法
亲和纯化方法同柱下酶切，洗脱液不含甘油，收集后加水大于三分之一。过
Q
柱，
AB
液配方中含有
10%
甘油，
8%B
洗脱
，
50%B
？直接洗下后积分定量，分装。
粗略定量参考
2000
峰宽为
10.5ml
，蛋白质总量为
24mg
，取了
12ml
，浓度为
2mg/ml
，直接分装的话，可以用
125ul
和
250ul
每
份。
积分定量方法举例
取
10ul ppase
浓缩液，
用本底缓冲液
（
PBS
）
稀释到
500ul
，
用上样泵做积分定量，
积分体积为
325mAu*
ml
，
可知浓缩好的蛋白质光吸收为每毫升为
< br>32.5Au
，光吸收为
1
，浓
缩好的蛋白质浓度为
32.5mg/ml
，一共
24mg
蛋白。
表达
1.
取
-80
度保存的质粒
pGEX-PPase
转化
BL21
< br>（
DE3
）感受态，涂布，
37
度孵箱培养
12~16
h
。
2.
挑取单克隆到
50ml LBA
培养基
37
度培养
12-15
小时。
3.
1%
接种到
1L TBA
中，培养
3
小时，
4
度水浴降温，加终浓度为
0.2mM
的
IPTG
，
15.3
度诱导培养
18
小时。
4.
4000rpm
离心
20
分钟收菌。加入
PB
SE
（
1mM EDTA
）至终体积<
/p>
30-40ml
重悬。
纯化
1
．
高压裂
解
2-3
次。
2
．
1.5
万转离心
30
分钟，留上清。
3
．
PBSS
平衡
5ml
的
GST
柱，上样，
PBSS
漂洗，
4
℃放置过夜，等
RN
A
降解，再用含有
10%
甘油和
0.1% Tween20
的酶切
buffe
r
漂洗干净。洗脱用含
10%
甘油的还
原性谷胱甘肽溶液，
2ml
每管收集，
取峰尖
3*1.5ml
。
4
．
上样泵
灌盐酸胍再生柱子，重力流灌水，灌
20%
乙醇，
4
℃保存柱子。
酶切效率确定
5ul
，
10ul
，
20ul
酶切
PH35C
蛋白
3-4
天，电泳检测酶切产物，全部切开了。估计
10ul
过夜酶切
1L
的
培
养产物足够，下次实验再做验证。
保存
用
PC
R
管，分装
50ul
每管，冻存于
-80
度。
使用
谷胱甘肽洗脱的融合蛋白，加入
1
份
PPase
，混匀后
4
度过夜酶切。
缓冲液
1
．
10*PBSS
（欧蒙基础）
配方：
5
包
PBS<
/p>
粉剂（欧蒙）
，加入
360ml 5M
NaCl
，定容到
500ml
，
4
℃保存。
2
．
500ml 2M Tris
（
pH8
.0
）
，
500ml 2M Tris
（
pH7.4
）
350ml
水溶解
121.1g
Tris
碱，加转子搅拌或振荡下溶解（需要
< br>10
分钟左右）
，加浓盐酸调
p
H
至所
需值，抽滤后
4
℃保存。
如温度升高，可加入预冷的水降温，温度下
降
1
度
pH
升
高
0.03
。
pH6.8
约需盐酸
160 ml
，
p
H7.4
约
需盐酸
70 ml
，
7.6
约需
60ml
，
8.0
约需
42ml
，
8.0
约需
40ml
。
Tris
缓冲液稀释
10
倍
p
H
下降
0.1
，故如稀释为
20mM
使用，则
pH
下
降
0.2
。
3
．
1L
2M Tris
不调
pH
800ml
水溶解
242.2g Tr
is
碱，加转子搅拌，定容至
1L
，抽
滤后
4
℃保存。
4
．
500ml 0.5 mM EDTA
将
93.05g
二水乙二胺四乙酸二钠加入
400ml
水中，加入氢氧化钠颗粒调节
pH
（约需
10g
氢氧化钠
颗粒）
，先加入
7g
左右，用搅拌棒彻底搅匀，在转子搅拌下，使
其大部分溶解，静置一会儿，使气
泡排出，并观察沉淀量。再继续搅拌，少量加入氢氧化
钠颗粒，观察
pH
变化，勿使其变化过快，
完全溶解后，加入
4
℃预冷的水（此时
pH
升高）
，继续调节
pH
为
8.0
，最终定容至
1L
，抽滤除去
杂质，避光保存于
4
℃。
5
．
10%
Tween 20
2ml Tween 20
，溶于
20ml
水，避光保存，千分之一稀释使用（根据
GE
资料）
。
6
．
250ml 20*
酶切
buffer
储存液
400mM Tris-
HCl (pH 7.0-pH 8.5), 3 M NaCl, 20 mM EDTA
配方：
2M Tris-HCL
50
ml
5M NaCL
150
ml
0.5M EDTA
10 ml
工作液成分（
2M Tris
稀释
100
倍使用，
pH
值会下降
0.2
）
：
20mM Tris-
HCl
，
150mM NaCl, 1 mM EDTA
作为漂洗液，使用前添加
0.1%
Triton
X100
（或者
Tween20
）
，做为酶切液使用前添加<
/p>
0.01%
Triton
（或者
Tween20
）和
1mM
DTT
。
7
．
100ml
20
×还原性谷胱甘肽储液
成分：<
/p>
200mM
还原型谷胱甘肽，
50mM
NaCl
，
1mM
EDTA
，
0.01% Triton X-100
（用欧蒙
Tween20
替代）
< br>，
100mM Tris
（
pH
8.0
）
50ml
< br>离心管
1
支，
称取
6.14g
还原型谷胱甘肽，
加
20ml 5M NaCl
，
4ml 0.5M
EDTA
，
0.2ml 10% Tween20
再加水溶解至
50ml
，
倒
入
100ml
烧杯，
再量取
50ml 2M Tris
（
pH8.0
）
，
倒入
100ml<
/p>
烧杯，
搅拌溶解，
滤器过滤至
50ml
离心管，
1ml
分装冻存于
-20
度。
8
．
500ml 7M
盐酸胍
称取
334.4g
盐酸胍，加水到
450ml
。定容，抽滤，室温保存。
PPase
信息
1
．
PPa
se
是人类鼻病毒蛋白酶
Human rhinovirus
B
从
11
号氨基酸（
< br>G
P
N
T
E
F
A
L
S
L
L
R
）
，
N
端接入
为
BamH
，尾端为
EcoR
。所用载体为
pGEX4t
2
．
pGE
X4t-HR14
载体表达蛋白质序列
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHL
YERDEG
DKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKL
TQSMAIIRYIAD
KHNMLGGCPKERAEISMLEGA
VLDIRYGVSRIAYSKDFE
TLKVDFLSKLPEMLK
MFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFML
YDALDVVL
YMDPMCLDAFPKLVCFKKRI
EAIPQIDKYLKS
SKYIAWPLQGWQA
TFG
GGDHPPKSDLVPRGSGGGPNTEFALSLLRKNIMTITTSKGEFTGLGIHDR
VCVIPTHAQPGDDVLVNGQKIRVKDKYKLVDPENINLEL
TVLTLDRNEKFRDIRGFISEDLEGVDA
T
LVVHSNNFTNTILEVGPVTMAGLINLSSTPTNRMIRYDYATKTGQCGGVL
CATGKIFGIHVGGNGR
QGFSAQLKKQYFVEKQ
3
．
蛋白质参数
Number of
amino acids: 410
Molecular weight:
46403.5
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