-
蛋白的表达和纯化
12.1 GST
蛋白的表达
(
1)
将表达
GST
融合蛋白的质粒转入
BL21
大肠杆菌菌株中。
(
2)
挑单克隆于
3ml LA(LB+Amp)
培养基中,37℃摇菌过夜,获得种子液。
(
3)
将种子液稀释于
50ml2XYTA(YTG+Amp)
培养基中,使起始
< br>OD600
为
0.1
。
(
4)
28℃,2
20rpm
摇菌培养
2
小时。
(
5)
加入
50
μ
l
100mM IPTG,16
~27℃摇菌培养
1
~
8
小时。
(
6)
收菌,将菌液倒入大离心管,
2
管
/50ml
菌液,4℃
5krpmx5min
离心,弃
上清。
(
7)
加入
10ml PBS/
管,重悬细胞
,5krpm
离心
5min
,弃上清。
(
8)
加入
2ml
PBS/
管,重悬细胞。转移至
5ml
离心管。
(
9)
超声破壁
破壁前,在细胞悬液中加<
/p>
20
μ
l 10mg/ml PMSF,
80
μ
l
蛋白酶抑制剂
(100x)
。
破壁参数:
Frequency:100
~
200
w
60s
,
pause
20s run 40s,5cycles
破至菌
体由浑浊变为澄清。
加
100
μ
l
20%
TritonX
-
100
p>
,冰上放置
30min
。
< br>
(
10)
将裂解液分入
p>
1.5ml
离心管中,4℃离心
12krp
m×10min,取上清。
(
11)
吸取少量上清,加入蛋白电泳上样缓冲液,在沸水中煮
3min
。离心
(
12krpm,1min
p>
)
,取上清作
SDS-
PAGE
电泳,检测表达情况。
12.2
准备
50%GST
Sepharose 4Bslurry
(
1)
将原
75%Glutathione Sepharose 4
B
的
slurry
弹至混匀。
(
2)
取
677
μ
l
原液
/
管,
3krpm
离
心
5min
,弃上清。
(
3)
加
500
μ
l
PBS
,颠倒混匀,
3krpm
离心
5min
,弃上清。反复
5
次。
(
4)
加
500
μ
l
PBS
,颠倒混匀,配成
50%Glu
tathione Sepharose 4B
备用。
12.3
GST
融合蛋白的纯化
(
1)
在新鲜制备的细胞裂解液上清
中加入
20
μ
l
50%Glutathione
Sepharose
4B
,
4℃,摇床上摇,反应
30min
~
60min
。<
/p>
(
2)
3k
rpm
离心
5min
,弃上清。该
p>
Sepahrose
上即结合了
GST
p>
融合蛋白,
(如果
仅仅是做纯化效果检测或
者蛋白表达量很高,
可以只接合一次,
如果要结合更多
则接着往下做)
(
3)
在管中加入离心后的
1.5ml
新鲜制备的细胞裂解液的上清,4℃,反应
< br>30min
~
60min
。
p>
3krpm
离心
5min
< br>,
弃上清。
重复该步骤多次,
就
可以使
Sepahrose
上结合
6<
/p>
~
10ml
裂解液中的
GST
融合蛋白。
(
4)
在管中加入预冷的
200
μ
l
PBS
p>
(沿壁加入,小心勿剧烈,以免打断珠子与
蛋白的联接)
,
轻晃悬浮珠子,将
Sepharose
洗涤一次,
3krpm
离心
< br>3min
,弃上
清。
(
5)
反复三次(最后一次以小枪吸
净珠子表面水膜,其余几次可以中枪吸,尽
量吸净但不吸走珠子)
,即获得结合有
GST
融合蛋白的
S
epharose
。
(
6)
如果用于检测,在
Sepharose
加入
15
~
20
μ
l
1×蛋白电泳上样缓冲液,在
沸水浴中煮
3min
。
12krpm
离心
1
min
,取上清作
SDS-
PAGE
电泳。
(
7)
如果用于
pull
-
down
测试,参见<
/p>
pull
-
down
步骤。
14.
体外蛋白质结合分析(
GST-
pull down
)
(
1)
将结合有
GST
融合蛋白的
Glutathione
Sepharose 4B
悬浮在
500
μ
lNETN
缓冲液中加入
20
p>
~
30
μ
l
含有其他蛋白的溶液,
例如
pET
发酵的产物
,
细胞表达的
产物等,同时采用结合有
GST
空蛋白的
Glutathione Sepharose
4B
平行操作作
为对照。
(
2)
在水平摇床上,
4
晃动
4
~
8
小时。
(
3)
离心(
3.6krpm,2min
)
。吸去上清,注意不要扰动底层
的
Sepharose.
(
4) <
/p>
加入
200
μ
l
缓冲液
H
对
S
epharose
进行洗涤。注意加入缓冲液
H
时要贴壁
加,不要直接冲击
Sepharose
,随后轻柔晃动,使
Sepharose
重悬
即可。
(
5)
低速离心(
3krpm
,
2min
)吸去上清,注意不要扰动底层的
Sepharose
。
(
6)
重复步骤的洗涤
2
~
3
次。
(
7)
吸干
Sepharose
上方的水层后
,加入
20
~
30
μ
l
1×蛋白电泳上样缓冲液,
沸水浴
4min
,冻存于-20℃。
(
8)
做
SDS-PAGE
和
Western
检测另一个蛋白。
GST
试验流程(梗概)
:
(
1
)
Glutathione
琼脂糖珠预处理。
(
2
)
GS
T
融合蛋白挂柱:取适量
GST-
融合
蛋白与
10
μ
l
已经处理过的
beads
置于
1.5
ml
离心管中,
4℃,
摇床孵育过夜。
(
3
)
p>
孵育过夜的蛋白质与
beads
的混合液于
4℃,500g
离心
5min
,上清收集,
观察融合蛋白是否饱和地挂在
be
ads
上,用
1ml
冰冷的细胞裂解缓
冲液洗三次
beads
。
(
4
)
p>
把转染目的基因的细胞(5×106)裂解在
0.5ml
细胞裂解液里(含蛋白酶
抑制剂)
,最大转速
p>
4℃离心
20min,
收集上清液。