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蛋白的表达和纯化
12.1 GST
蛋白的表达
（
1)
将表达
GST
融合蛋白的质粒转入
BL21
大肠杆菌菌株中。
（
2)
挑单克隆于
3ml LA(LB+Amp)
培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。
（
3)
将种子液稀释于
50ml2XYTA(YTG+Amp)
培养基中，使起始
< br>OD600
为
0.1
。
（
4)
28℃,2
20rpm
摇菌培养
2
小时。
（
5)
加入
50
μ
l
100mM IPTG,16
～27℃摇菌培养
1
～
8
小时。
（
6)
收菌，将菌液倒入大离心管，
2
管
/50ml
菌液，4℃
5krpmx5min
离心，弃
上清。
（
7)
加入
10ml PBS/
管，重悬细胞
,5krpm
离心
5min
，弃上清。
（
8)
加入
2ml
PBS/
管，重悬细胞。转移至
5ml
离心管。
（
9)
超声破壁
破壁前，在细胞悬液中加<
/p>
20
μ
l 10mg/ml PMSF,
80
μ
l
蛋白酶抑制剂
(100x)
。
破壁参数：
Frequency:100
～
200
w
60s
，
pause
20s run 40s,5cycles
破至菌
体由浑浊变为澄清。
加
100
μ
l
20%
TritonX
－
100
，冰上放置
30min
。
< br>
（
10)
将裂解液分入
1.5ml
离心管中，4℃离心
12krp
m×10min，取上清。
（
11)
吸取少量上清
，加入蛋白电
泳上样缓冲
液
，在沸水中煮
3min
。离心
（
12krpm,1min
）
，取上清作
SDS-
PAGE
电泳，检测表达情况。
12.2
准备
50%GST
Sepharose 4Bslurry
（
1)
将原
75%Glutathione Sepharose 4
B
的
slurry
弹至混匀。
（
2)
取
677
μ
l
原液
/
管，
3krpm
离
心
5min
，弃上清。
（
3)
加
500
μ
l
PBS
，颠倒混匀，
3krpm
离心
5min
，弃上清。反复
5
次。
（
4)
加
500
μ
l
PBS
，颠倒混匀，配成
50%Glu
tathione Sepharose 4B
备用。
12.3
GST
融合蛋白的纯化
（
1)
在新鲜制备的细胞裂解液上清
中加入
20
μ
l
50%Glutathione
Sepharose
4B
，
4℃，摇床上摇，反应
30min
～
60min
。<
/p>
（
2)
3k
rpm
离心
5min
，弃上清。该
Sepahrose
上即结合了
GST
融合蛋白，
（如果
仅仅是做纯化效果检测或
者蛋白表达量很高，
可以只接合一次，
如果要结合更多
则接着往下做）
（
3)
在管中加入离心后的
1.5ml
新鲜制备的细胞裂解液的上清，4℃，反应
< br>30min
～
60min
。
3krpm
离心
5min
< br>，
弃上清。
重复该步骤多次，
就
可以使
Sepahrose
上结合
6<
/p>
～
10ml
裂解液中的
GST
融合蛋白。
（
4)
在管中加入预冷的
200
μ
l
PBS
（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与
蛋白的联接）
,
轻晃悬浮珠子，
将
Se
pharose
洗涤一次，
3krpm
离心
3min
，
弃上
清。
（
5)
反复三次（最后一次以小枪吸净珠子表面水膜，其余几次可以中枪吸，尽
量吸
净但不吸走珠子）
，即获得结合有
GST
融合蛋白的
Sepharose
。
（
6)
如果用于检测，在
Sepharose
加入
15
～
20
μ
l
1×蛋白电泳上样缓冲液，在
沸水浴中煮
3min
。
12krpm
离心
1
min
，取上清作
SDS-
PAGE
电泳。
（
7)
如果用于
pull
－
down
测试，参见<
/p>
pull
－
down
步骤。
14.
体外蛋白质结合分析（
GST-
pull down
）
（
1)
将结合有
GST
融合蛋白的
Glutathione
Sepharose 4B
悬浮在
500
μ
lNETN
缓冲液中加入
20
～
30
μ
l
含有其他蛋白的溶液，
例如
pET
发酵的产物
,
细胞表达的
产物等，同时采用结合有
GST
空蛋白的
Glutathione Sepharose
4B
平行操作作
为对照。
（
2)
在水平摇床上，
4
晃动
4
～
8
小时。
（
3)
离心（
3.6krpm,2min
）
。吸去上清，注意不要扰动底层
的
Sepharose.
（
4) <
/p>
加入
200
μ
l
缓冲液
H
对
S
epharose
进行洗涤。注意加入缓冲液
H
时要贴壁
加，不要直接冲击
Sepharose
，随后轻柔晃动，使
Sepharose
重悬
即可。
（
5)
低速离心（
3krpm
，
2min
）吸去上清，注意不要扰动底层的
Sepharose
。
（
6)
重复步骤的洗涤
2
～
3
次。
（
7)
吸干
Sepharose
上方的水层后
，加入
20
～
30
μ
l
1×蛋白电泳上样缓冲液，
沸水浴
4min
，冻存于－20℃。
（
8)
做
SDS-PAGE
和
Western
检测另一个蛋白。
GST
试验流程（梗概）
：
（
1
）
Glutathione
琼脂糖珠预处理。
（
2
）
GS
T
融合蛋白挂柱：取适量
GST-
融合
蛋白与
10
μ
l
已经处理过的
beads
置于
1.5
ml
离心管中，
4℃,
摇床孵育过夜。
（
3
）
孵育过夜的蛋白质与
beads
的混合液于
4℃,500g
离心
5min
，上清收集，
观察融合蛋白是否饱和地挂在
be
ads
上，用
1ml
冰冷的细胞裂解缓
冲液洗三次
beads
。
（
4
）
把转染目的基因的细胞
（5×106）
裂解
在
0.5ml
细胞裂解液里
（含蛋白酶
抑制剂）
，最大转速
4℃离心
20min,
收集上清液。
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