-
·
因为你
IP
的时候用
的抗体，
为了说明是你的抗体特异性的
IP
下来的东西，
而不是其他抗体
IP
下来的，所以要用
IgG
作为对照。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质
-
蛋白质间结合的保持下来。
这一事实可被用于检测和确定生
理条件下相关的蛋白质
-
蛋白质之间的相互作用。这种方法叫做
免疫共沉淀
IP
是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的
“prorein A
特异性地结合到免疫球蛋白的
FC
片段的现
象活用开发出来的方法。
目前多用精制的
prorein A<
/p>
预先结合固化在
argarose
的
beads
上，
使
之与含有抗原的溶液及抗体反应后，
beads
上的
prorein A
就能吸附抗原达到精制的目的。
其
优点为：（
1
）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天
然状态；（
2
）蛋白
的相互作用是在自
然状态下进行的，可以避免人为的影响；（
3
）可以分离得到天
然
状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（
1
< br>）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质
－蛋白质相互作用；（
< br>2
）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在
中间起桥梁作用；
（
3
）
必须在实验前预测目的蛋白是什么，
以选择最
后检测的抗体，
所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
实验流程为：
（
1
）
转染后
24-48 h
可收获细胞，
加入适量细胞裂解缓冲液
（含蛋白酶抑制
剂）
，
冰上裂解
30min,
细胞裂解液于
4°
C
，
最大转速离心
30
min
后取上清；
（
2
）取少
量裂解液以备
Western blot
分析，剩余裂解液加<
/p>
1μg
相应的抗体加入
到细胞裂解液，<
/p>
4°
C
缓慢摇晃孵育过夜；
（
< br>3
）取
10μl protein A
琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗
3
次，每次
3,000
rpm
离心
3
min
；
（
4
）将预处理过的
< br>10μl protein A
琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解
液中
4°
C
缓慢摇
晃孵育
2-4h
，使抗体与
prote
in A
琼脂糖珠偶连；
（
5
）免疫
沉淀反应后，在
4°
C
以
3,000 rpm
速度离心
3 min
，将琼脂糖珠离心
至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用
1ml
< br>裂解缓冲液洗
3
－
4
次；最后加入
15μl
的
2×
SDS
上样缓冲液，沸水煮
5<
/p>
分钟；
<
/p>
（
6
）
SDS-
PAGE, Western
blotting
或质谱仪分析。
注意的问题：
（
1
）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白
< br>质相互作用，多采用非离子变性剂（
NP40
或
Triton X-100)
。每种细胞的裂解条件是
< br>不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（
0.2
％
SDS)
，细胞裂解液中要加
各种
酶抑制剂，如商品化的
cocktailer
。
（
2
）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
（
3
）使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的
IgG
或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔
IgG
在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几
点：
(1)
确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并
非外源非特异蛋白，
单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
(2)
要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起
共沉淀；
(3) <
/p>
确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，
这需要进行蛋白质的定位来确定。
免疫共沉淀技术路线
准备工作：
预冷
PBS
，
RIPA
Buffer
，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1.
用预冷的
PBS
洗涤细胞两次，最后一次吸干
PBS
；
2.
加入预冷的
RIPA Buffer
（
1ml/10
7
个细胞、
10cm
培养皿或
150cm2
培养
瓶，0.5ml/5×10
6
个细胞、
6cm
培养皿、
75cm2<
/p>
培养瓶）
3.
用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到
1.5EP
管中，4℃，缓慢晃动
15min
（<
/p>
EP
管插冰上，置水平摇床上）
4. 4℃，
14000g<
/p>
离心
15min
，立即将上清转移到一个
新的离心管中
5.
准备
Protein A agarose(
< br>琼脂糖珠
)
，用
PBS
洗两遍珠子，然后用
PBS
配
制成
50%
浓度，
建议减掉枪
尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6.
每
1ml
总蛋白中加入
100
μ
l
Protein
A
琼脂糖珠
（
50%
）
，
4℃摇晃
10min
（
EP
管插冰上，置水平摇床上），以
去除非特异性杂蛋白，降低
背景
7.
4℃，
14000g
离心
1
5min
，
将上清转移到一个新的离心管中，
< br>去除
Protein
A
珠子
8.
（
Bradford
法）做蛋
白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀
释
1
：
10
倍以上，
以减少
细胞裂解液中去垢剂的影响
（定量，
分装后，
< br>可以在
-
20℃
保存一个月）<
/p>
9.
用
< br>PBS
将总蛋白稀释到约
1
μ
g/
μ
l
，以
降低裂解液中去垢剂的浓度，
如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（
如
10
μ
g/
μ
l
）
10.
加入一定体积的兔抗到
500
μ
l
总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白
在不同细胞系中的多少而异
11.
4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温
2h
，激酶或磷酸酯酶活性分析
建议用
2 h
室温孵育
12.
加入
100
μ
l
Protein
A
琼脂
糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动
抗原抗体混合物过夜或室温
< br>1h
，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加
2
μ
l“过
渡抗体”（兔抗鼠
IgG
，兔抗鸡
IgG
）
13.
14000rpm
瞬时离心
5s
，收集琼脂糖珠
-
抗原抗体复合物，去上清，用预
冷的
RIPA buffer
洗
3
遍，
800
μ
l/
遍，
RIPA buffer
有时候会破坏琼脂糖珠
-
抗
原抗体复合物内部的结合，可以使用
PBS
14.
用
60
μ
l
2×上样缓冲液将琼脂糖珠
-
抗原抗体
复合物悬起，轻轻混匀，
缓冲液的量依据上样多少的需要而定（
60
μ
l
足够上三道）
15.
将上样样品煮
5min
，以游离抗原，
抗
体，珠子，离心，将上清电泳，
收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻
< br>-
20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮
5min
变性。
RIPA
Buffer
配制：
基础成分：
Tris-
HCl
（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl
（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40
（非离子去污剂，提取蛋白；用
H2O
配制成
10%
储存
液）
去氧胆酸钠
（离子去污剂，
提取蛋白；
用
< br>H2O
配制成
10%
储存液；<
/p>
避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂
能够
使酶变性，导致活性丧失。
RIPA
蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（
PMSF
）
（用异丙醇配制成
200mM
的储存液，室温保存）
EDTA
（钙螯合剂；用
H2
O
配制成
100mM
的储存液，
PH 7.4
）
亮抑酶肽（
Leupeptin
）（用
H2O
配制成
1mg/ml
的储存液，分装，
-
20℃保
存）
抑蛋白酶肽（<
/p>
Aprotinin
）（用
H2O
配制成
1mg/ml
的储存液，分装，
-
20℃
保存）
胃蛋白酶抑制剂
（
Pepstatin
）
（用甲醇配制成
1mg/ml
的储存液，
分装，
< br>-
20℃
保存）
RIPA
磷酸（酯）酶抑制剂
激活的
Na3VO4
（用
H2O
配制成
20
0mM
的储存液，见
Sodium
Orthovanadate
Activation
Protoco
）
NaF
（
200mM
的储存液，室温保存）<
/p>
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制
100ml
的
modified RIPA
buffe
：
1.
称取
790mg
的
Tris-
Base
，
加到
75ml
去离子水中，
加入
900mg
的
NaCl
，
搅拌，直到全部溶解
，用
HCl
调节
PH
< br>值到
7.4
2.
加
10 ml
10%
的
NP-40
3.
加
2.5 ml
10%
的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4.
加
1 ml 100m
M
的
EDTA
，用量筒定容到
100ml
，
2-
8℃
保存
5.
理论上，蛋白
酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶
肽，亮抑酶肽
< br>,
胃蛋白酶抑制剂各
100 ?l; PMSF,
Na3VO4, NaF
各
500 ?l），但
是
PMSF
在水溶液中很不稳定，
30
分钟就会降解一半，所以
PMSF
应该在使用前
现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定
5
天。
各种成分在工作液中的终浓度：
? Tris
-HCl: 50 mM, pH 7.4
? NP
-40: 1%
? 去氧胆酸钠：
0.25%
? NaCl: 150 mM
? EDTA: 1 mM
? PMSF: 1 mM
? 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽
,
胃蛋白酶抑制剂
:
各
1 ?g/ml
? Na3VO4: 1 mM
? NaF: 1 mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1
．用磷酸盐缓冲液洗
30
块
10
cm
培养板上的适宜细胞。刮去每块板上
的细
胞到
1 ml
冰冷的
EBC
裂解缓冲液中。
2
．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上
4
℃以最大速
度离心
15
min
。
3
．
收集上清
（约
30
ml
）
并加入
30<
/p>
μ
g
的适当抗体，
4℃摇动免疫沉淀物
1
h
。
4
．加入
0.9
ml
的蛋白质
A-Sepharose
悬液，4℃摇动免疫沉淀物
30
min
。
5
．用含
900 mmol/L NaCl
的
NETN
洗蛋白
A-Sepha
rose
混合物，再重复洗
5
次。最后
，用
NETN
洗一次。
6
．
吸出混合物的液体部分。
加入
800
μ
l
的
1×SDS
胶加样缓冲液到球珠中
，
煮沸
4
min
。
7
．将样品加入到大孔的不连续
SDS-
PAGE
梯度胶中，在
10
mA
的恒定电流下
电泳过夜。
8
．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9
．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用
1ml
50%
乙腈洗两次，
每次
3
min
。
10
．
用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11
．
通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在
ABI 477A
或
494A
机器
上进行自动
Edman
降解测序。
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