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染色质免疫沉淀分析
ChIP
技术介绍
染色质免疫沉淀分析
ChIP
技术介绍
(
Chromatin
Immunoprecipitation Assay,
ChiP
)
(
Abcam
公司和
Upstate
公司都提供
ChIP
抗体产品)
染色质免疫沉淀法(
Chromatin
immunoprecitation
,
ChIP
)是研究体内
DNA
与
蛋白质相互作用的重要工具。它可以灵敏地检测目标蛋白与特异
DNA
片段的结
合情况,
还可以用来研究组蛋白与基因表达
的关系。
核小体组蛋白可以发生多种
翻译后的共价修饰,如乙酰
化、甲基化、磷酸化、泛素化等,这些共价修饰与真
核基因的表达密切相关。
根据“组蛋白密码”假说,
组蛋白的各种共价修饰的组
合会以协同或拮抗的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,
ChIP
也为研究组
蛋白修饰在基因表达中的作用,
全面阐
明真核基因的表达调控机制提供了强有力
的研究工具。
真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的,
所有信号传递途径
的终点都
是
DNA
。
< br>DNA
通过核蛋白复合物组成染色质,染色质是基因调控的一个重要作用
位点。
转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制
--
“组蛋
白密码”,
其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。
该类修饰包括组蛋白磷
酸化、乙酰化、甲基化、
ADP-
核糖基化等过程
。随着越来越多组蛋白核心结构区
域和羧端修饰的确定,
组蛋白
密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明
确。参与修饰的酶根据其作用的不同而
分类:如组氨酸乙酰转移酶(
HATs
)可以
< br>将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(
HDACs
)可以去除氨基酸上的乙酰
基团;
组蛋白甲基转移酶
(
HMTs
)
可以将甲基
基团转移到组蛋白上等不同组氨酸
修饰标记对应于不同的生物学过程,
< br>它可以作为调节因子的作用位点,
也可以用
来改变染色质
结构。
染色质免疫沉淀分析
(
ChiP
)
是基于体内分析发展起来的方法,
它的基本原理是
在活细胞状态下固定蛋白质-
< br>DNA
复合物,
并将其随机切断为一定长度范围内的<
/p>
染色质小片段,
然后通过免疫学方法沉淀此复合体,
特异性地富集目的蛋白结合
的
DNA
片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与
DNA
相互作用
的信息。它能真实、完整地反映结合在
DNA
序列上的调控蛋白,是目前确定与
特定蛋白结
合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好
的方法。
CHIP
不仅可以检测体内反式因子与
DNA
p>
的动态作用,还可以用来研究
组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关
系。而且,
CHIP
与其他方法的结合,扩
< br>大了其应用范围:
CHIP
与基因芯片相结合建立的
CHIP-on-chip
方法已广泛用
于特定反式因子靶基因的高通量筛选;
CHIP
与体内足迹法相结合,用于寻找反
式因子的体内
结合位点;
RNA-CHIP
用于研究
RNA
在基因表达调控中的作用。由
此可见,随着
CHIP
的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越
p>
重要的作用。
凝胶电泳迁移率改变分析<
/p>
(
EMSA
)
是
目前研究转录调控蛋白和相应核苷酸序列结
合的常用方法,但是由于许多转录调控蛋白有
相似或相同的
DNA
结合位点,这
种
体外分析获取的结果不一定能真实地反映体内转录调控蛋白和
DNA
< br>结合的状
况。染色质免疫沉淀分析(
ChIP
)是基于体内分析发展起来的方法,它能真实、
完整地反映结合在
DNA
序列上的调控蛋白,是目前确定与特定蛋白结合的基因
组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。
ChIP <
/p>
技术和芯片技
术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分
布模式以及组蛋白修饰情
况。
ChIP
基本试剂盒和特定蛋白质抗体结合完成一个染色质免疫沉淀分析。
染色质免疫沉淀技术(
Chroma
tinImmunoprecipitation
,简称
ChI
P
)是研究体内蛋白
质与
DNA
相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体
内蛋白因子与基因组
DNA
结合的状况。
特别是近年来由于该技术不断的发展和完善,
其应用范围已经从研究目的蛋白与已知
靶序列间的相互作用,
发展到研究目的蛋白与
整个基因组的未知
序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与
DNA
的相互作用,发
展
到研究两个蛋白与
DNA
共同结合的
相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,
发展到研究结合在
DNA
序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入,这
项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。
目前已经有成熟的
< br>ChIP
试剂盒出售,
如
Mil
lipore
公司提供的
EZ-ChIP
试剂盒,使得越来越多的研究者更容易地采用染色
质沉淀技术在许多研究领域取得了成
功。
染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的
DNA
与蛋白质交联在
一起,通过超声
或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,
将与目的蛋白相结合
的
DNA
片段沉淀下来。
染色质免疫沉
淀技术一般包括细胞固定,
染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,
DNA
的纯化,以及
DNA
的鉴定。
因为
ChIP
实验涉及的步
骤多,结果的重复性较低,所以对
ChIP
实验过程的每一步<
/p>
都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用
ChIP
技术的研究人员来说,使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服
务会达到事半
功倍的效果,比如
Millipore
公司的
EZ-ChIP
试剂盒就是专门为初学者设
计的入门产
品。
< br>它的原理是在保持组蛋白和
DNA
联合的同时,
通过运用对应于一个特定组蛋白标记的
生物抗体,染色质被切成很小的片
断,并沉淀下来。
IP
是利用抗原蛋白质和抗体的特异性
结合以及细菌蛋白质的
“prorein A”
特异性地结合到免疫球蛋白的
FC
片段的现象活用开发出
p>
来的方法。
目前多用精制的
prorein
A
预先结合固化在
argarose
的
beads
上,
使之与含有抗原
的溶液及抗体反应后,
beads
上的
prorein A
就能吸附抗原达到精制的目的。
< br>实验最需要注意
点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合
未必能用在
IP
反应。建
议仔细检查抗
体的说明书。
特别是多抗的特异性是问题。
其次,
要注意溶解抗原的缓冲液的
性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架
蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必
须使用含有强界面活性剂的缓冲液,
尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。
另一面,
如
用弱界面活性剂溶解细胞,
就不能充分溶解细胞蛋白。
p>
即便溶解也产生与其它的蛋白结合的
结果,抗原决定族被封闭,影响
与抗体的结合,即使
IP
成功,也是很多蛋白与抗体共沉的
p>
悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温<
/p>
下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体
/
缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过
多则就不能沉降在
beads
上,
残存在上清。
缓冲
剂太少则不能溶解抗原,
过多则抗原被稀释。
染色质免疫沉淀法(
Chromatin
immunoprecitation
,
ChIP
)是研究体内
DNA
与蛋白质相互作用的
重要工具。
它可以灵敏地检测目标蛋白与特异
DNA
片段的结合情况,
还可以用来研究组蛋白与基因表达的<
/p>
关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰,如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化
等,这些共价
修饰与真核基因的表达密切相关。根据
“
组蛋白密码
”
假说,组蛋白的各种共价修饰的组
合会以协同或拮抗
的方式诱导特异的下游生物学功能,因此,
C
hIP
也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用,全面阐明真核
基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。
真核生物细胞
状态是由内源和外源因素共同影响的,
所有信号传递途径的终点都是
DNA
。
DNA
通过
核蛋白复合物组成染色质,染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研
究
显示存在一种新的调节机制
--
“<
/p>
组蛋白密码
”
,其信息存在于组蛋白的转
录后修饰等过程中。该类修饰包括组
蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、
ADP-
核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修饰的确
定,
组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用越来越明确。
p>
参与修饰的酶根据其作用的不同而分类:
如组氨酸乙酰转移酶(
p>
HATs
)可以将乙酰基团转到组蛋白上;组蛋白去乙酰酶(
HDACs
)可以去除氨基
酸上的乙酰基团;
组蛋白甲基转移酶(
HMTs
)可以将甲基基团转移到组蛋白上
等不同组氨酸修饰标记对
应于不同的生物学过程,它可以作为调节因子的作用位点,也可
以用来改变染色质结构。
染色质免
疫沉淀分析(
ChiP
)是基于体内分析发展起来的方法,它的
基本原理是在活细胞状态下固
定蛋白质-
DNA
复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此
复合体,特异性地富集目的蛋白结合的
DNA
片段,通
过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与
DN
A
相互作用的信息。
它能真实、
完整地反映结合在
DNA
序列上的调控蛋白,
是目前确定
与特定蛋白结合的
基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。
CHIP
不仅可以检测体内反式因子与
DNA
的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,<
/p>
CHIP
与其他方法的
结合,扩大了其应
用范围:
CHIP
与基因芯片相结合建立的
CHIP-on-chip
方法已广泛用于特定反式因子靶
基因的高通量筛选;
CHIP
与体内足迹法相结合,用于寻找反
式因子的体内结合位点;
RNA-CHIP
用于研
究
RNA
在基因表达调控中的作用。
由此可见,
随着
CHIP
的进
一步完善,它必将会在基因表达调控研究中
发挥越来越重要的作用。
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