-
FRET
在生物科学中的应用
作者：
文富
来源：
北
大单分子与纳米生物学实验室
时间：
2007-12-4
荧光共振能量转移（
FRET
）
(Fluorescence / F?
rster resonance
energy transfer)
是比较分子
间距离与分子直
径的有效工具，
广泛用于研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，
可以定
量测量两个发光基团之间的距离，在蛋白
质空间构象、蛋白与蛋白间相互作用、核酸与蛋
白间相互作用以及其它一
些方面的研究中得到广泛应用。
当生色团被光照时，被照射激发的分子可以通过散
发能量来返回到基态
1-3
。光能可被生
色团在
10-15
秒吸收而在
< br>10-9
秒再发射出来。然而，也有可能被激发分子并不发光而将能
量传递给别的生色团
或是另外的荧光素，这些荧光
素可以在相同的时间量级发荧光，这后
一种现象称为荧光共振能量转移（
FRET
）。
FRET
是通过
分子间的电偶极相互作用将供
体
激发
态能量转移给受体激发态的过程，
是一种非辐射跃迁。
当
FRET
发生时，
供体的荧光减
弱而受体的荧光增强。荧光素在激发态的寿命是
10
-9
秒，
在发射荧光、非辐射性发射
和将
激发能传递给周围的介质三者之间存在竞争。
如果荧光能量
转移发生，
激发态能就会从供体
传递给受体，荧光光子由受体发
出。
FRET
发生的基本条件是：
①、供体和受体的距离必须达到一定的数量级（
20-100?
）②、
受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠。（见图
1
）③、供体和受
体能量转移偶极
子的方向必须近似地平行。
F?
rster
依据供体与受体的相对距离和偶极子的方向关系解释了
FRET
发生的原理。
能量转移的效率是有一些参
数决定的
1-3
，下面方程给出了
能量转移的
产效：
E=R
6
0
/
（
R
6
+R
6
< br>0
R
是供体与受体在生物条件下的距离
R
0
是每对供受体之间的一个常数，
代表
能量转移的效率为
50
％时的距离。
R
0
称为
F?
rster
临
界距离，由下列公式计算：
κ
2
表
示偶极子方向因子（围从
0-4
；当供体和
受体的排列是随机时
κ
2
=2/3
）
QY
D
表示在没有受体
时供体的量子产量
n
表示折射系数
J(λ)
表示光谱重叠积分
J(λ)
其
中：
=
受体淬灭系数
=
总荧光强度中供体荧光强度部分
图
1
：
FRET
光谱重叠积分示意图
能量转移发生在供体受体距离在
0.5-10nM
之间。
供受体分子之间存在电荷
-
电荷
库仑力
作用，
激发态的供体对于受体的作用是偶极子
-
偶极子的电动
力学空
间作用。
如果条件具备：
供受体的激发谱、
吸收谱相互重叠，
供体的量子产量和受体的吸收系数适当、
方向合适就极
有可能发生能量转移。能量转移的速率和
供受体的距离有函授关系（与距离达到六次方的
倒数成比例）能量转移
后供体回到基态、
光子发射可能性减少，供体的激发态寿命减短，受
体可因受激发而发出光
子，尽管起初是由供体激发的，我
们检测到的荧光光谱却是由受体
发出的。
我们可以从能量转移的速率和效率得到许多信息：可以知道供受体的距离很近（约
0
.5-10nM
），得到距离的数量，有时能得到它们的方位关系。一般地每一
对供受体可被分
别考虑，
每对都由于其特殊的距离和方位和光谱特征而表现出其能量转移的可能性，
这就使<
/p>
我们能直接掌握分子的结构、
空间构象变化和结合反应。
如果我们观察的是一个分子集合，
我们得到的
是对应于相关参数分配的光谱信息。
这种光谱参数分配能提供分子构象分配情况
信息。能量转移是一个时间依赖过程，
我们能
够得到的有关发生在能量转移和荧光衰减时
间数量级、
分子运动
和分子转动的动力学信息，
这个数量级可以是皮秒到毫秒数量级。
这是
一个非常广的时间区
段，可以
灵活地选择生色团。在所有荧光技术中，
FRET
的独特性就<
/p>
在于此。
在多数情况下，供体与受体染
料是不同的，
FRET
的可以通过对供体的荧
< br>
光淬灭和受体的
敏化荧光的产生来检测。
当供体和受体是相同的染料时，
可通过荧光的去极化来检测。
因为
R0
是受环境影响的，
在
实际中具体的实验条件下它的值
是可变化的。
不产生荧光的受体比
如
dabcyl
< br>和
QSY
染料的优势在于能够减少可能由受体本身直接产
生的荧光背景的干扰。
对
于相互作用的分子之间的
FRET
分析往往受到供受体荧光素各组分之间的
相互影响并影响
FRET
的效率。比如：如果所有的供体都与一
个受体结合了，供体荧光寿命就随两者距离的
改变
而呈一次幂变化。但在一种混合状态，有不同的供受体距离或有未结合的供体得到的
是荧光寿命衰减的多次幂变化，
未发生作用的分子对
F
RET
的效率产生影
响。
。
高的
FRET
效率和低
的相互作用分子浓度可导致一个错误推论认为在供体受体之间有小的或没有相互
作用。如
果蛋白相互作用的细胞定位空间大小超出了
显微成像的分辨率
，那么我们获得的
是一种平均值，也会导致对生物效应的错误解释
16
。多光子显微技术尤其是双光子技术比
共聚焦显微镜更有
优势。使用近红外
激发光引起探针荧光素的非线性吸收，因而
激发光在
聚焦镜平面的强度被限制在一个小的剂量围，
荧光淬灭
和光对样品的损伤大大减少，
对于光
敏感的样品的观
察也成为可能。
用
FLIM(fluorescence lifetime
imaging microscopy)
是一种较新的检测
F
RET
的方法
2
。
FLIM
技术有两种：
时间域<
/p>
(time-domain)
和频率域
(frequency-domain)
。①、
时间域是短的脉
冲光激发样品，荧光信号强度作为时间的函数。最新的
TCSPC(time
–
correlated-single-proton-
counting )
技术与多光子激发系统的结合使得分辨率达到在组织和
细胞飞升（
femto-litre
）的水平。<
/p>
TCSPC
的原理：样品被脉冲的激光重复激发，而每次
脉
冲激发的能量远不能引起一个光子发射。<
/p>
光子检测器能启动定时器，
并在下一次脉冲到来时
停止计时此过程反复重复，就得到了荧光衰减的直方图。
TCSPC
被
认为比较费时间，但
TCSPC
以其近乎理想的计数效率和低的激发光剂量（减少荧光淬灭和毒性作用）以及
高的
时间分辨率而优于现有的其他方法。
在计数速度为
1MHZ
时，
获得<
/p>
10000
个光子花
20
毫秒，
一个
128*128
像
素的图象在
3
分钟完成，
这样得到的信
躁比要比那些靠牺牲分辨率来提高速
度或为了缩短
时间而牺牲信躁比要更优越。②、频率域原理：样品被强度调制的激发光激
发，
激发光的频率和样品荧光寿命的倒数成比例。
这时荧光的发
射频率与调制的频率一
致，
时间变化
和解调也与激发光一致，
可用来计算荧光寿命。
这种技术被广泛
应用在远场和共聚
焦显微技术上。
生物科学的一个巨大挑战就是决定组成生物
< br>结构的分子或超分子的空间距离和分布，许多
的生物现象是发生在相互作用分子的
界面上，
能够告诉我们有关分子相互作用的技术对我们
非常重要
。一旦相互分离的
的目标空间排列被明确、距离和相互的方向
明确了，我们就更
能确信地提出生物结构是如何发挥作用的设想并证实它。
对于空间关系的了解也使我们能更
好地解释动
态现象，知道了一部分结构的空间位置帮助我们进一步提出一些分子间相互作
用的具体的问题。
FRET
被广泛应用的原因是它提供
了分子间的距离、方向（定位）
和动
力学特征的信息，更好地回答有关分子距离数量级的问题。
FRET
的应用
：
⑴、可用于研究蛋白质以及蛋白复合体的结构和空间构象与布局
Xing J
用
FRET
研究了肌凝蛋白亚结构（
A S1
）部的运动情况<
/p>
5
。他们把
DABMI
< br>连接于
CYS374
上，作为受体荧光素，再用两种不同
的荧光素
IAEDANS
和
MIANS
先后标于
SH1
和
SH2
上。在紧态的
AS1
中，当用
MIANS
作为供体荧光素时，<
/p>
SH1
和
SH2
两个位点的距
离大致相等（
45?
），
而加入
ADP
和
Vi(orthovanadate)
后，
CYS374<
/p>
和
SH1
的距离缩短了
< br>7-8A
，而
SH2
与
CYS374
的距离未见变化。当以
AEDAN
S
作为能量供
体荧光素时得到类
似的结果。结论为
MgADP
和
Vi
导致了
SH1
向肌动
蛋白的位点运动而
SH2
对于
S1
相对饱
和的激动位点不敏感而不发生相对运动。
Yin Luo
4
等人用
FRET
结合几何分析手段研究了兔子骨骼肌肌钙蛋白的四级结构和<
/p>
IN1-INC
二聚体
（
TN1
）
上的突变
CYS133
相对于
INC
上九个突变
CYS
的定位情况，
分别就钙离子
存在和不存在两种情况进行比较，用（
1
，
5-IAEDANS
）作为荧光供体
，
DAB-MAL
或
DDP-
MAL
为
荧光受体通过
FRET
测量
CLYS133
和每个
INC
上的突变
CYS
残基的距离，
再用数学方法处理
INC
晶体结构数据和
FRET
测量值，得到各
CYC
残基
在<
/p>
IN
中的定位。
该结果对于揭示
IN1
在
IN
复合体中
的定位以及
IN
的功能有很大的提示作用。
Erickson
JW
6
等
用
FRET
确定在转导蛋白上鸟苷酸结合位点（
< br>α
-T
）的赖氨酸残基与
CGM
P
磷酸二脂酶
γ
亚基（
γ
-PDE
）构象敏感位点的半胱氨酸残基（
68
残基）的位
置关
系。半胱
氨酸残基
（
68
残基）
在
γ
-PDE
的位点对于有活性或失活的
α
-T
的结合敏感而引起构象改变。
这一点被实验所证实：
将
α
-T-GDP
复合体加
入被对环境敏感的探针
（
MIANS
）
标记的
γ
-PDE
亚基能引起
MIANS
< br>荧光的增强，而氟化铝使
α
-T-GDP
激活后再结合到
γ
-PDE
时
会导致
MIANS
荧光的淬灭。氟化
铝引起的
MIANS-
γ
-PDE
的荧光变化的时间和
α
-T
的部荧光的变
化相一致，而这一时间也对应于
α
-T
活性空间构象变化
的时间。这些结果提示活化状态的
α
-T
< br>亚结构导致了临近的
γ
-PDE
的半胱氨酸残基（
68
残基）结合位点的空间结构的变化。
Christoph Biskup14
等用
confocal
和
streak
照相机观察了钠离子通道亚单位之间的关系。钠
离子通道在可兴
奋组织可形成动作电位，它由一个孔状的
α
亚基和
β
亚基组成
α
亚基能单<
/p>
独发挥功能。人心肌的钠离子通道
β1
亚
基仅仅对
α
亚基有轻微影响，它帮助提高峰电位的
强度以及加速从失活状态恢复。
峰电位的强
度的增加提示
β1
亚基导致了质膜上通道的密
度
增加，可以猜想
α
亚基在向质膜转运
的过程是在早期已经和
β1
亚基结合。为了证实这个猜
想，他们用了能提高
FRET
效率的方法：固定模式的激光、共聚焦显微镜和
streak
< br>照相机。
两个亚单位分别用兰色和黄色荧光蛋白标记，在人的胎肾细胞（
HEK293
）表
达
。质网膜
的通道亚基之间的
FRET
表
明两亚单位在到达质膜之前就已经结合了。
该方法能同时测量供
体和受体的荧光的衰减并提供了测量
FRET
效率的有效
方法。
⑵、研究蛋白质的折叠
蛋白质折叠是
一个非常繁杂的过程，
因为它涉及到大量的途径来将无数去折叠构象连接成为
唯一的天然构象。在用实验方法来探索各
个途径
所占比例的漫长过程中，
FRET
已经能够
测量自由状态的单分子蛋白折叠的表面自由能特征，这些数据在分子集合是难以得到的。
受体
/
配体相互
作用。
Benjamin Schuler15
等将一个绿色供体染料和一个红色受体染料连接
在冷休克蛋白（
CspTm
）
（来源于超嗜温细菌
Thermotoga maritime
）的氨基和羧基端的半胱
氨酸残基上。
选择该蛋白是因为它的高度稳定性，
< br>能够承受结构方面的干扰以及它的在分子
集合实验中的热力学和动力学
行为的简单性。
如果一个折叠好的
CspTm
被激光照射，
被激
发的供体染料将能量快速传递给受体染料，
因为它们的间隔仅仅
1
纳米，
大部分光子由受体
发出。<
/p>
当
加入化学变性剂后蛋白去折叠，
导致供体和受体的平均距离变大，
能量转移变小，
< br>被受体发射的光子减少。为了使结果量化，由两种不同长度的标记相同染料的多聚
脯氨酸
螺旋作为控制系统，
在供体和受
体之间构成了固定的间隔，
使染料之间的距离不因变性而变
化，
其他的参数和实验组的参数一样变化。通过相关参数的比较处
理，得到去折叠的多肽
重新形成构象的时间限度和折叠自由能障的高度限制，结果与简单
的统计模型一致。如图
2
所示：
图
2
：示意图：用荧光供体（
Alexa488
）和荧光受体
(Alexa594)
标记的蛋白和多聚脯氨酸螺
旋
a
：折叠的
CspTm
，含
66
个氨基酸残基（
蛋白资料来自
Protein Data
Bank
）
b
：去折叠
的
CspTm
c
：
(Pro)6;
d
：
(Pro)20
蓝色的激发光激发绿色供体染料，后者把能量转移给红色
的受体染料。
在每种模式中，
FRET
的效率
E
和距离
R
的函数关系用兰色
的曲线表示，
供
体
< br>和受体染料的距离的分配概率
P
用红色曲线表示。
⑶、免疫测定
免疫分子之间的相互作用和各种免疫现象可结合
FRET
加以研究，
如利用抗原与抗体、
补体
与抗体、
CD
分子之间的特异结合可发挥
FRET
的优势，目前
FRET
在免疫方面的应用已有
很多。
Morrison LE22
等用长寿命供体和短寿命受体、脉冲激光以及电子门控
检测器将受体
射线中来源于能量转移的部分和来源于吸收激发光的部分分开。理论方程表
明提高与激
发
脉冲相关的积分延搁能
大大加强来源于能量转移的部分。
人免疫球蛋白
IgG Fab
'
的抗体被标
记上
pyrenebut
yrate
而
IgG Fab'
被藻红
素（
B-phycoerythrin
）标记，在氮激光的激发
下，溶液
中产生了从
pyrenebutyrate
到
B- phycoerythrin
的
FRET
，受体荧光检测用
0
和
20
纳秒两种
积分延搁，在
三个系列的免疫测定中，当用
20
纳秒积分时测量时，受体荧光
中来源于能量
转移的部分和来源于吸收
激发光的部分的比率增加了
9-15
倍，
实验数据和理论预测基本一
致。
⑷、单分子间相互作用
如何得到单分
子之间作用的信息？
FRET
作为一种有效的工具已经应用的这
方面的研究。
Ha
T21
等用
FRET
来探讨两个单分子之间的相互作用。
他们用近场扫描显微镜观察单个的供体
和单个的受体得到双色图象，并得到用短
DNA
分子连接的供体和受
< br>体荧光素的发射光谱。
光裂解动力学用于研究
FRET<
/p>
的出现和效率。
经典的测算分子集合能量转移的方程改变为单
分子测算。与分子集合测量不同的是单分子水平
< br>的动力学事件是可以用单对
FRET
来观察
的，
因为该结果并不为分子集团的随机平均化所消除。
对于发生在纳米尺度的象旋转、
位置
变化或构象变化等现象可
以用
单对
FRET
< br>来研究。
⑸、核酸的结构与空间构象
Xiaowei Zhuang19
等人用
FRET
研究了单分子的四膜虫嗜热核酸酶的催化作用和折叠。
用染
料标记并且表面固定的核酸酶在功能上和未加以修饰的核酸酶没有区
别。能够观察到从酶
中心开始的双链
docks
和
und
ocks
的可逆折叠过程的单分子时间轨迹，并能确定折叠速度
常数和转变态的特征。
很难在分子集合出现和在分子集合水平衡量的
docked
态的全部折
叠
过程、中间折叠态以及折叠的多条途径都被观察到了，除此之外又发现了一种折叠常数为
1/
秒的新的折叠途径
TomaszHeyduk Eua Heyduk12
用<
/p>
FRET
检测序列特异的
DNA
结合蛋白的活性。两个
DNA
片段各构成大约一
半蛋白结合位点的
DNA
链，分别用供体荧光素和受体荧光素标
记。两片
段有短的
互补区可供退火连
接。互补区的长度和片段的浓度都保持在一定水平使自发的退
火连接非常少，在没有蛋白
出现时无能量转移的发生。当结合蛋白出现时，它对于全
段的
DNA
的高亲和力将促使两片段连接，
特异蛋白
—
DNA
复合物出现，
供体和受体荧光素因而
靠近发生高效的
FRE
T
信号。如图
3
所示：
图
3
：
A <
/p>
、
DNA
特异结合蛋白与
DNA
序列设计示意图
B<
/p>
、
蛋白结合位点的几种可能的拼
接方式（
小方框和小圆圈分别表示荧光的供体和受体）
FRET
已经被用于研究一系列荧光标记的结合到大肠杆菌
DNA
聚合酶
1 Klenow
片段的
< br>DNA
和引物的单链构象
20
。
DNA
片段被
tetramethyl
rhodamine (TMR)
所修饰作为
FRET
的
受体，荧光供体由双突变
KF
得到，。模板引物的设计允许探针在蛋白和
DNA
复合
体的位
置随着引物链的扩展
（加入脱氧三磷酸
< br>
核苷酸引起）
而变化。
TMR
受体探针占据了模板引
物的七个位置（五个在单链区，两个在双
链区）。每个位置的
FRET
效率由受体出现和消失
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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