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细胞破碎技术—超声波破碎

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-08 08:02
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-

2021年2月8日发(作者:扩展名)









< br>超








摘要:




细胞破碎技术的基本概念及其基本方法,重点介绍了从超声波破碎仪及超声波破碎常见的问题与解决方法上介绍 了


超声波破碎法。



关键词:


细胞破碎



方法



超声波破碎仪



常见问题



正文:




一、细胞破碎阻力



细菌——



几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖(


peptidoglycan


)组成,它是难溶性< /p>


的聚糖链(


glycan chain


) ,借助短肽交联而成的网状结构,包围在细胞周围,使细胞具


有一定的形状和强度。短肽 一般由四或五个胺基酸组成,如


L-


丙氨醯

-D-


谷氨醯


-L-


赖氨醯


-D-


丙氨酸。而且短肽中常有


D-


胺基酸与二氨基庚二酸存在。



破碎细菌的主要 阻力是来自


于肽聚糖的网状结构,其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽 键的数量和


其交联的程度,如果交联程度大,则网结构就致密。



酵母菌——酵母细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成,它构成了细胞壁的刚性骨


架,使细胞具有一定的形状,覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白,最外层是甘露聚糖,由


1,6


一磷酸二酯键共价连接,形成网状结构。在该层的内部,有甘 露聚糖


-


酶的复合物,它


可以共价连接 到网状结构上,也可以不连接。与细菌细胞壁一样,破碎酵母细胞壁的阻力


主要决定于壁 结构交联的紧密程度和它的厚度。



真菌——霉菌的细胞壁主 要存在三种聚合物,葡聚糖(主要以


β


-1,3


糖苷键连接,某


些以


β


-1, 6


糖苷键连接),几丁质(以微纤维状态存在)以及糖蛋白。最外层是

< br>α


-



β


-


葡聚糖的混合物,第


2


层是糖蛋白 的网状结构,葡聚糖与糖蛋白结合起来,第


3


层主要是


蛋白质,最内层主要是几丁质,几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞


壁一样,真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关,不仅如此,它还含有几丁质或纤维


素的纤维状结构,所以强度有所提高。



植物细 胞——对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。



初生壁


是细胞生长期形成的。



次生壁是细胞停止生长后,在初生壁内部形成的结构。



目前,较


流行的初生细胞壁结构是由


Lamp ert


等人提出的“经纬”模型,依据这一模型,纤维素的


微纤 丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面,同一层次上的微纤丝平行排列,


而不 同层次上则排列方向不同,互成一定角度,形成独立的网路,构成了细胞壁的


“经”,模 型中的“纬”是结构蛋白(富含羟脯氨酸的蛋白),它由细胞质分泌,垂直于


细胞壁平面 排列,并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网,径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白


网之间又相 互交联,构成更复杂的网路系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网路之中,


从而使整个 细胞壁既具有刚性又具有弹性。



在次生壁中,纤维素和半纤维 素含量比初生


壁增加很多,纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则,而且存在木质素(酚 类组分的聚合


物)的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性,使植物细胞具有很 高的机械强


度。




二、细胞破碎各类方法



目前已发展了 多种细胞破碎方法,以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。



碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。



机械法



。(


1


)高压匀浆破碎法(


homogenization


),高压匀浆器是常用的设备,它


由可产生高压的正向排代泵(


positive


displacenemt


pump


)和排出阀(


discharge


valve



组成,排出阀具有狭窄的小孔,其大小可 以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内,在高


压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出, 并射向撞击环上,由于突然减压和高速冲击,使


细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作 方式上,可以采用单次通过匀浆器或多次循环通


过等方式,也可连续操作。为了控制温度 的升高,可在进口处用干冰调节温度,使出口温


度调节在


20< /p>


℃左右。在工业规模的细胞破碎中,对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长


静止期的细胞,常采用多次循环的操作方法。(


2


) 振汤珠击破碎法


(Skaking Bead)


,将


等体积的小量组织样品与高密度的


ZircoBeads


放入可密封的


2ml


螺旋盖微量管中

< br>,


再加入


缓冲液与稳定成份到


1 .5ml


的体积


,



6500RPM


振汤机高速上下振动


8



,


休息


8

< br>秒


,


再振


8


秒即可


.


此方法是目前最快且一 次可处理最多样品的方法


.


一台机器最多可以在一天


处理


2400


支样品。


对小量且多样的人很方便


.



3



高速搅拌珠研磨破碎法


< br>fine


grinding





4



研磨 是常用的一种方法,它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起


快速搅拌 ,使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中,常采用高速珠磨机



。(


5


)超声波破


碎法



ultrasonication





超声波破碎法利用超声波振荡器发射的


15-25kHz


的超声波


探头处理细胞悬浮液 。



超声波振荡器有不同的类型,常用的为电声型,它是由发生 器和


换能器组成,发生器能产生高频电流,换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。 超声


波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式,一般破碎效果后者比前者好。 撞击


破碎法。





非机械法。(


1

< br>)渗透压冲击破碎法(


osmotic shock


), 渗透压冲击是较温和的一种


破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油 或蔗糖溶液),由于渗透压


的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡 后,将介质快速稀释,或将


细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅 速渗入胞内,引起细胞快速


膨胀而破裂。



2



冻融破碎法



freezing


and


thawing





将细胞放在低温下冷冻


(约


-15


℃)


,然后在室温中融化,反覆多次而达 到破壁作用。由于冷冻,一方面能使细胞膜的


疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能 ,另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细


胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体, 可采用此法。(


3


)酶溶破碎法(


enzyme


lysis





酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分 或完全破坏


后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。溶 菌酶



lysozyme)


适用于革兰 氏阳性菌细胞的分解,应用于革兰氏阴性菌时,需辅以


EDTA


使之


更有效地作用于细胞壁。



真核细 胞的细胞壁不同于原核细胞,需采用不同的酶。(


4


)化


学破碎法(


chemical treatment

< br>),采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用


酸、碱、表面活性剂和有 机溶剂等化学试剂。去垢剂破碎法(


detergents


)。




三、超声波破碎法




超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它是一种波动形式,因此它可以用于探测


人体的生理及病理信息,既诊断超声。同时,它又是一种能量形式,当达到一定剂量的超


声在生物体内传播时,通过它们之间的相互作用


,


能 引起生物体的功能和结构发生变化,


即超声生物效应。超声对细胞的作用主要有热效应, 空化效应和机械效应。热效应是当超


声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子 震动,使部分能量转化为局部高热



42-43


℃)


,因为正常组织的临界致死温度为


45.7


℃,而肿瘤组织比正常组织敏感性高,


故在此温度下肿瘤细胞的代谢发 生障碍,


DNA



RNA


、蛋白质合成受到影响,从而杀伤癌细


胞而正常组织不受影响。空化效应是在 超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和


其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和 动荡,使肿瘤出血、组织瓦解以致坏死。另外,空

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